闊葉十大功勞葉中生物堿的紫外誘導(dǎo)及相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、次生代謝在1891年首次被Kossel提出以區(qū)別于初生代謝，植物次生代謝在抵抗生物和非生物協(xié)迫時(shí)扮演著重要的角色，植物次生代謝物是藥物、精細(xì)化學(xué)品和食品添加劑的主要來源。很多次生代謝物具有抗菌，抗病毒和抗真菌的作用，能保護(hù)植物免受病原體的侵害，但這些化合物的產(chǎn)量很低(通常小于植物干重的1％)。雖然化學(xué)合成和植物細(xì)胞培養(yǎng)可以生產(chǎn)這些代謝物，但由于多數(shù)次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成的收率較低，成本很高，植物細(xì)胞培養(yǎng)，雖然有一定的可行性，但成

2、本控制仍是其發(fā)展的瓶頸。而利用非生物脅迫，提高在體或離體植物組織中次生代謝產(chǎn)物的含量，具有成本低，無(wú)污染，簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，越來越受到產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界的重視，其中紫外光是一種重要的誘導(dǎo)因子。
　　紫外光根據(jù)波長(zhǎng)范圍可分為三種:UV-A(320-400 nm)、UV-B(290-320 nm)和UV-C(200-290 nm)，作為一種非生物脅迫因子，它對(duì)地球生物產(chǎn)生了顯著的影響。近年來，由于臭氧層持續(xù)減少，地球表面的UV-B輻射持續(xù)增

3、加，為了適應(yīng)這一變化，植物中具有吸收UV-B作用的次生代謝產(chǎn)物相應(yīng)大幅度增加。
　　到目前為止，從植物中已經(jīng)報(bào)道了十萬(wàn)余個(gè)次生代謝化合物，其中，生物堿已成為第二人類化合物，它具有很好的UV-B吸收作用。但基于UV-B照射引起的次生代謝產(chǎn)物變化的分子機(jī)理研究較少。
　　蛋白質(zhì)組是指一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，因此對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象

4、的本質(zhì)提供直接的依據(jù)。差異蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，包含了特異蛋白的表達(dá)模式和功能模式，是研究植物生理、發(fā)育和遺傳的重要工具，著重于篩選和鑒定不同種類或狀態(tài)下各樣本間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化，具有很好的可行性。應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究藥用植物對(duì)外界刺激的應(yīng)答和適應(yīng)性，可以更好地了解藥用植物應(yīng)答外界刺激的蛋白和造成生物活性物質(zhì)改變的合成途徑。
　　組合肽配體庫(kù)是一種新生技術(shù)，能減少樣品中蛋白濃度的動(dòng)態(tài)變化，富集低豐度蛋白，通稱

5、為“ProteoMine”，已廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物的蛋白質(zhì)組研究，但是，在植物中的應(yīng)用很少，只在擬南芥，南瓜和波菜中有簡(jiǎn)單應(yīng)用。涉及到次生代謝產(chǎn)物的酶通常為低豐度蛋白，在植物中低豐度蛋白的檢測(cè)經(jīng)常受到高豐度蛋白，如占植物蛋白總量40％的Rubisco的影響，導(dǎo)致其很難被檢測(cè)到。組合肽配體庫(kù)是一種成本效益高，時(shí)效性強(qiáng)的低豐度蛋白富集工具，對(duì)于一些無(wú)法通過免疫沉淀等方法來富集的蛋白是一種好的選擇，因此，它在植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方面具有潛在的應(yīng)

6、用價(jià)值。
　　十大功勞是一種常綠灌木，屬于小檗科十大功勞屬，是一種重要的藥物植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它具有很好的藥理活性，如抑菌消炎、降血糖，抗氧化以及抗癌等多種生物活性。關(guān)于十大功勞活性成分研究，已很透徹。生物堿是其主要的生物活性物質(zhì)，而含量較高的主要是小檗堿，藥根堿，非洲防己堿和巴馬汀等。傳統(tǒng)上十大功勞以根入藥，大量的采集，必然會(huì)引起植物資源的匱乏，也嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境。
　　本課題應(yīng)用UV-B誘導(dǎo)技術(shù)，對(duì)活體闊葉十大功勞

7、葉進(jìn)行了深入研究。通過對(duì)6小時(shí)UV-B照射，不同時(shí)間培養(yǎng)后的指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)闊葉十大功勞中次生代謝產(chǎn)物有顯著的變化。與對(duì)照組相比，藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀和小檗堿分別增加了919.6％，391.4％，192.4％和33.1％。為了揭示UV-B誘導(dǎo)闊葉十大功勞產(chǎn)生異喹啉生物堿的生物合成機(jī)理，本課題采用雙向電泳，組合肽配體庫(kù)和RT-PCR技術(shù)對(duì)其生物合成機(jī)制進(jìn)行了研究，通過MALDI-TOF-MS鑒定，普通雙向電泳得到了13個(gè)差異點(diǎn)