重組日本七鰓鰻rLj—RGD3與其KGD突變體的抗血管新生、抗血小板聚集活性比較.pdf

1、rLj-RGD3為來自七鰓鰻口腔唾液腺中含有三個RGD模體的RGD毒素蛋白，并且與組氨酸富含糖蛋白HRG具有序列同源性。RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性，但是由于作用靶點不同而涉及不同的信號通路。本文關(guān)注于rLj-RGD3及其KGD突變體蛋白抗血小板聚集和抗血管新生活性的比較研究。KGD模體具有與血小板細胞膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa專一性結(jié)合，而與血管內(nèi)皮細胞表面高表達的整合素αvβ3不結(jié)合的特點，因此含有KGD模體的蛋白

2、具有專一性抗血小板聚集而對血管新生無抑制作用的特性，從而有利于開發(fā)出專一性抗血栓新藥。通過對野生型rLj-RGD3進行RGD模體替換為KGD模體的突變，獲得了系列KGD模體突變蛋白，包括rLj-116、rLj-28和rLj-26。對上述突變體蛋白的純化物進行了抗血管新生和抗血小板聚集活性的研究。采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304為體外血管新生模型對其抗血管新生活性進行了比較研究:MTT細胞增殖實驗結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116抑

3、制ECV304細胞增殖的IC50分別為0.562μmol/l和0.832μmol/l，rLj-26和rLj-28均沒有明顯抑制作用;細胞凋亡實驗表明rLj-RGD3和rLj-116均具有劑量依賴性誘導細胞發(fā)生凋亡的作用，而rLj-26和rLj-28不能誘導ECV304發(fā)生凋亡;采用Transwell細胞培養(yǎng)板檢測各蛋白對bFGF誘導ECV304細胞遷移的抑制作用，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116對ECV304細胞遷移的抑制作用顯

4、著，而rLj-28作用差異不明顯， rLj-26無抑制作用。利用人工基質(zhì)膜基質(zhì)Matrigel及Transwell模仿體內(nèi)環(huán)境，研究rLj-RGD3與三種突變體蛋白對ECV304細胞浸潤的抑制作用，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116均明顯抑制以bFGF為趨化劑的ECV304細胞穿透Matrigel的浸潤行為，而rLj-28作用不明顯，rLj-26無抑制作用;以雞胚絨毛尿囊膜(chickenchorioallantoic membr

5、ane，CAM)作為體內(nèi)血管新生模型，測定了各蛋白對體內(nèi)血管新生的抑制作用，結(jié)果表明rLj-116和rLj-RGD3對CAM的血管新生具有明顯的抑制作用，其余實驗組均無顯著效果;采用兔的富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)系統(tǒng)進行血小板聚集測試，結(jié)果顯示rLj-RGD3和rLj-116的抗血小板聚集作用比較顯著，呈劑量依賴關(guān)系，且rLj-116的抑制作用要遠遠強于rLj-RGD3，其他實驗組則均無明顯作用。由此