FOXO3a與ROS的相互作用及對(duì)人胚胎干細(xì)胞中胚層與心肌定向分化的影響.pdf

1、背景：
　　近年來，我國(guó)心血管病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，心梗等缺血性心臟病引起的急、慢性心衰已經(jīng)成為目前重要的死亡原因。由于成人的心肌細(xì)胞損傷后的再生能力低下，因此，目前臨床上對(duì)于缺血性心臟病的治療仍是以阻止疾病進(jìn)展，保護(hù)殘存心肌功能為主。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，可在體外定向誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，這就使通過人為替代病損心肌、恢復(fù)心功能從而治療缺血性心臟病及心衰成為可能。但是，由于目前人多能干細(xì)胞心肌

2、定向誘導(dǎo)分化過程的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，使體外誘導(dǎo)分化的效率與純度都遠(yuǎn)未達(dá)到移植治療的要求。因此只有充分闡明心肌定向分化的調(diào)控機(jī)理，才能提高分化效率使其盡早用于臨床。
　　目的：
　?、庞^察人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧及轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化。⑵改變心肌分化過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，觀察ROS變化對(duì)人胚胎干細(xì)胞心肌定向分化進(jìn)程和效率的影響。⑶觀察FOXO3a敲低對(duì)人胚胎干細(xì)胞及其在心肌定向分化

3、過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。⑷觀察FOXO3a敲低后人胚胎干細(xì)胞心肌定向分化過程中中胚層特異性標(biāo)記基因表達(dá)的影響。
　　方法：
　?、偈褂肏2DCFDA探針和CellROX橘色探針檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞內(nèi)源性活性氧水平的變化。②通過蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)分化過程中FOXO3a蛋白水平。③分別使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）和丁硫氨酸-亞砜亞胺（BSO）降低和提高細(xì)胞內(nèi)源性ROS的水平。④通過實(shí)時(shí)熒光

4、定量 PCR技術(shù)檢測(cè)分化過程細(xì)胞中胚層及心肌分化特異性標(biāo)記基因的表達(dá)情況。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌分化末期，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中心肌特異性標(biāo)記肌鈣蛋白 T（TroponinT）的陽性比例。
　　結(jié)果：
　　⑴人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中，ROS水平在誘導(dǎo)初期迅速上升，至第2～4天達(dá)到峰值，之后下降但仍保持在較高水平。⑵人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中，F(xiàn)OXO3a蛋白在誘導(dǎo)第4天開始升高第6-8天達(dá)到峰值，隨后下降但仍保持在較

5、高水平。⑶分別使用抗氧化劑NAC或強(qiáng)氧化劑BSO處理細(xì)胞，能有效降低或提高了心肌定向分化過程中細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。⑷抗氧化劑NAC處理組較未處理組人胚胎干細(xì)胞心肌定向分化末期 cTNT陽性細(xì)胞比率較低且細(xì)胞數(shù)量明顯減少；強(qiáng)氧化劑BSO處理組心肌定向誘導(dǎo)分化末期cTNT陽性細(xì)胞比率較未處理組高。⑸人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中，NAC處理組較未處理組中胚層心肌特異性基因表達(dá)降低或者峰值延遲，BSO處理組較未處理組中胚層與生心中胚層特異

6、性基因表達(dá)升高或峰值提前。⑹FOXO3a抑制人胚胎干細(xì)胞的ROS水平較正常對(duì)照組升高，并且心肌分化過程中中胚層與生心中胚層特異性基因表達(dá)也明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　?、偃伺咛ジ杉?xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化明顯且與FOXO3a的表達(dá)水平變化一致，F(xiàn)OXO3a可能是心肌分化過程中內(nèi)源性ROS水平的重要調(diào)節(jié)因子。②人胚胎干細(xì)胞心肌定向誘導(dǎo)分化早期，細(xì)胞內(nèi)源性ROS水平的升高對(duì)于中胚層與生心中胚層分化至關(guān)重要