小鼠植入前胚胎DNA甲基化模式比較及Dnmts啟動(dòng)子功能分析.pdf

1、為考查體外受精、操作及培養(yǎng)環(huán)境對(duì)體外受精的小鼠植入前胚胎全基因組DNA甲基化模式的影響，本研究以體內(nèi)受精的植入前胚胎作為對(duì)照，采用間接免疫熒光法檢測(cè)小鼠體內(nèi)外受精植入前胚胎基因組DNA甲基化模式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：體外受精各期植入前胚胎呈現(xiàn)出與之相應(yīng)時(shí)期的體內(nèi)受精植入前胚胎不同的DNA甲基化模式和水平，原核期甲基化水平較高，2－、4－、8－細(xì)胞期明顯降低，而桑葚胚和囊胚期又略有升高。各期體外受精植入前胚胎的基因組DNA甲基化水平都比同時(shí)期體

2、內(nèi)受精胚胎的甲基化水平低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分顯示了體外受精、操作及培養(yǎng)環(huán)境可能對(duì)正常的DNA甲基化模式產(chǎn)生了影響，造成了體外受精植入前胚胎甲基化模式異常。作為基因表達(dá)開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)子是開(kāi)啟基因表達(dá)的重要順式元件，可以受到反式因子的調(diào)控進(jìn)而啟動(dòng)或關(guān)閉基因的表達(dá)。在本研究中，我們克隆小鼠Dnmtl、3a，3b基因啟動(dòng)子，構(gòu)建了四段Dnmtl，3a、3b啟動(dòng)子5’缺失片段-pGL3分別稱(chēng)為Dnmtl-1、2、3、4，Dnmt3a-1、2、3、4，Dn

3、mt3b-1、2、3、4以及Sox2、Oct4、Nanog，Klf4，c-Myc-pcDNA3.1，將轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)重組質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因的相對(duì)活性，考查轉(zhuǎn)錄因子對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子活性的影響。研究結(jié)果表明：五種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Dnmtl-1活性的抑制作用較弱，而對(duì)Dnmtl-2、3、4活性的抑制作用較強(qiáng)。對(duì)Dnmt3a啟動(dòng)子各5’缺失片段的活性仍然是起到抑制作用，但不同的

4、的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Dnmt3a啟動(dòng)子各5’缺失片段活性的抑制程度不同。Nanog對(duì)Dnmt3a-1活性的抑制作用較為明顯，而對(duì)Dnmt3a-2、3、4的活性抑制作用差別不大；轉(zhuǎn)錄因子Oct4，c-Myc主要抑制區(qū)域出現(xiàn)在Dnmt3a-1啟動(dòng)子片段和Dnmt3a-2啟動(dòng)子片段之間；Sox2對(duì)Dnmt3a4個(gè)啟動(dòng)子片段的抑制作用區(qū)別不明顯。5種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Dnmt3b-2、3啟動(dòng)子片段活性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，其活性是對(duì)照組的7倍以上，但是轉(zhuǎn)錄因子對(duì)D