19F定點(diǎn)標(biāo)記及19F核磁共振方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、在此論文中我們主要討論了應(yīng)用非天然氨基酸標(biāo)記和19F核磁共振相結(jié)合的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué),論文共分為六個(gè)章節(jié)。
　　 第一章簡要概述了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系,以及用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)力學(xué)的核磁共振方法。蛋白質(zhì)功能的多樣性與其空間結(jié)構(gòu)密不可分,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的功能活性基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是內(nèi)部動(dòng)態(tài)的過程,動(dòng)力學(xué)特性對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮具有重要作用。NMR方法可以在很寬的時(shí)間尺度上進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的研

2、究。針對大分子量蛋白和信號靈敏度較低的情況下,可以采用固體核磁共振和位點(diǎn)特異性氨基酸標(biāo)記的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)力學(xué)的研究。
　　 第二章介紹了用非天然氨基酸位點(diǎn)特異性標(biāo)記的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。核磁共振能夠研究適當(dāng)大小蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合、構(gòu)象變化等,研究更大的蛋白質(zhì)需要發(fā)展硬件以及同位素標(biāo)記方法等。由于大分子量蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目較多,弛豫較快,線寬很寬,信號較弱,往往導(dǎo)致重疊的核磁譜峰難以進(jìn)行歸屬。單氨基酸特

3、異性標(biāo)記可以減少核磁譜峰的重疊,但是對于含有很多同種氨基酸的大蛋白還是解決不了問題。但是位點(diǎn)特異性非天然氨基酸標(biāo)記只有一個(gè)核磁信號出現(xiàn),使得核磁信號的歸屬非常容易。本章介紹了目前用于核磁共振研究的非天然氨基酸的種類和標(biāo)記方法,分別介紹了液體和固體核磁在非天然氨基酸標(biāo)記研究中的應(yīng)用。
　　 第三章描述了應(yīng)用19F位點(diǎn)特異性氨基酸標(biāo)記的方法對蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)分析。我們成功的化學(xué)合成了主鏈和側(cè)鏈雙標(biāo)記非天然氨基酸15N／l9FtfmF,

4、用一對正交的氨酰tRNA合成酶/tRNACUA實(shí)現(xiàn)了將雙標(biāo)記非天然氨基酸插入到水溶性蛋白和膜蛋白的特異性位點(diǎn)。對人源Vinexin蛋白C末端第一個(gè)SH3domain進(jìn)行了配體結(jié)合前后的動(dòng)力學(xué)分析。將15N/19FtfmF標(biāo)記在SH3結(jié)構(gòu)域的三個(gè)不同位點(diǎn),得到了三個(gè)不同位點(diǎn)的主鏈和側(cè)鏈化學(xué)位移。對SH3在配體P868結(jié)合前后的主鏈(15N)1H、側(cè)鏈19F的化學(xué)位移和弛豫分析表明,三個(gè)不同位點(diǎn)在配基結(jié)合前后具有不同的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)。接著我們用S

5、H3結(jié)構(gòu)域在60％甘油中的樣品模擬了大分子量蛋白的運(yùn)動(dòng),對其一維19F譜和側(cè)鏈T1、T2進(jìn)行了分析。另外,我們對膜蛋白DGAK三聚體在DPCmicell中的化學(xué)位移和側(cè)鏈弛豫分析表明,這種非天然氨基酸位點(diǎn)特異性標(biāo)記的方法可以用于分析膜蛋白的側(cè)鏈內(nèi)部運(yùn)動(dòng)。
　　 第四章闡述了19F位點(diǎn)特異性氨基酸標(biāo)記方法的其他應(yīng)用。首先以膜蛋白DAGK為例,分析了19F位點(diǎn)特異性氨基酸標(biāo)記在膜蛋白溶劑暴露中的研究,結(jié)果表明位于DAGK不同位置的氨

6、基酸殘基化學(xué)位移的變化是不同的,與已知三維結(jié)構(gòu)中殘基的位置分布一致。其次,應(yīng)用位點(diǎn)特異性19F弛豫增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)(PRE)對一個(gè)多結(jié)構(gòu)域蛋白L27tan的兩種結(jié)構(gòu)構(gòu)象進(jìn)行了辨認(rèn)。通過檢測半胱氨酸上的自旋標(biāo)記物MTSL和位點(diǎn)特異性標(biāo)記的氨基酸t(yī)fmF之間的PRE效應(yīng),判斷兩個(gè)位點(diǎn)在空間結(jié)構(gòu)上的距離。結(jié)果表明,L27tan在溶液中采取關(guān)閉型的構(gòu)象。最后是對19F位點(diǎn)特異性標(biāo)記膜蛋白DAGK的原位固體核磁共振研究。用原位MAS固體核磁共振的方法對D

7、AGK在天然膜環(huán)境中的化學(xué)位移和側(cè)鏈弛豫進(jìn)行了分析。與DAGK/DPC樣品的液體核磁數(shù)據(jù)比較表明,位于膜蛋白不同位置的氨基酸殘基的化學(xué)位移和縱向弛豫受膜環(huán)境的影響不同。
　　 第五章主要概括了對BK鉀離子通道跨膜螺旋S0和S1之間loop(S0-S1loop)的液體核磁共振研究。BK鉀離子通道是一種大電導(dǎo)鉀離子通道,能夠被Ca2+、Mg2+和電壓所激活,在許多生理過程中發(fā)揮重要作用。與其他電壓門控鉀離子通道不同的是,BK鉀離子通

8、道具有7個(gè)跨膜螺旋和S0-S1loop,我們用液體核磁共振的方法對S0-S1loop的二級結(jié)構(gòu)和主鏈動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析。Xplor-NIH結(jié)構(gòu)計(jì)算表明S0-S1loop中有兩個(gè)雙親的α螺旋,可能與細(xì)胞膜或者跨膜螺旋有相互作用。Mg2+滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)的S0-S1loop存在時(shí)T45和L46有化學(xué)位移擾動(dòng)而Mg2+結(jié)合位點(diǎn)D99卻沒有化學(xué)位移變化。
　　 第六章主要展望了如何利用19F非天然氨基酸標(biāo)記的方法將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力