馬圓線蟲(chóng)COI和nad1序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析.pdf

1、圓線蟲(chóng)是馬屬動(dòng)物體內(nèi)最重要的寄生蟲(chóng)，嚴(yán)重危害宿主的健康，使其患病乃至死亡，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失。大量使用驅(qū)蟲(chóng)藥使盅口線蟲(chóng)出現(xiàn)抗藥性，增加了患病率。馬屬動(dòng)物寄生圓線蟲(chóng)的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，對(duì)于有針對(duì)性地控制圓線蟲(chóng)病具有重大意義。目前，國(guó)外學(xué)者為圓線蟲(chóng)的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資料，國(guó)內(nèi)對(duì)于圓線蟲(chóng)的研究較少，且主要是形態(tài)學(xué)方面的研究，缺乏相關(guān)分子資料。本研究以采自河南新鄉(xiāng)地區(qū)的35種圓線蟲(chóng)為研究對(duì)象，經(jīng)光學(xué)顯微鏡初步鑒定后，通過(guò)PCR

2、技術(shù)擴(kuò)增其線粒體COⅠ和nad1基因，探究馬圓線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。35種圓線蟲(chóng)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序共獲得39條COⅠ序列和32條nad1序列。通過(guò)使用多種生物學(xué)軟件，對(duì)所得目的片段進(jìn)行了堿基組成、遺傳距離等分析。采用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分別基于COⅠ和nad1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并且構(gòu)建基于COⅠ和nad1聯(lián)合數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)樹(shù)。發(fā)現(xiàn)BI法更適合馬圓線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴所測(cè)樣品的COⅠ序列長(zhǎng)度

3、均為393 bp，通過(guò)多序列比對(duì)顯示，其中保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單核苷酸位點(diǎn)分別占總位點(diǎn)的64.63％、35.37％、29.52％、5.85％。A+T平均含量(67.3％)明顯高于G+C(32.7％)，表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏好性。從氨基酸密碼子來(lái)看，第三位點(diǎn)的A+T平均含量最高(78.6％)，第二位點(diǎn)(63.1％)稍高于第一位點(diǎn)(61.2％)。轉(zhuǎn)換和顛換比值R最大的是第1密碼子位點(diǎn)，其次是第3密碼子位點(diǎn)，進(jìn)化最快，第2密碼子

4、位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生堿基替換，進(jìn)化最慢。基于COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)顯示，種內(nèi)個(gè)體均聚為獨(dú)立分支，對(duì)于屬以上分類階元的區(qū)分結(jié)果不夠理想，但仍有一定的參考價(jià)值。⑵測(cè)序所得32條nad1序列的總長(zhǎng)度均為354 bp，對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，其中保守位點(diǎn)218個(gè)，變異位點(diǎn)136個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)115個(gè)，單核苷酸位點(diǎn)21個(gè)。A、C、G、T四種堿基的平均含量為25.4％、9.8％、21.7％、43.1％，A+T平均含量(68.5％)明顯高于G+C(31.

5、4％)，表現(xiàn)出AT堿基偏倚性。就氨基酸密碼子來(lái)看，A+T平均含量最高(74.2％)的是第3位點(diǎn)，第1位點(diǎn)(66.1％)和第2位點(diǎn)(65.1％)相差不大。三個(gè)密碼子位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換和顛換比值R最小的為第3密碼子位點(diǎn)，進(jìn)化最快，其次是第1密碼子位點(diǎn)，第2密碼子位點(diǎn)的R值最大，進(jìn)化速率最慢。在構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中，31種圓線蟲(chóng)形成兩大類群:一個(gè)大類群包括圓形屬、三齒屬和卡拉干斯齒線蟲(chóng)、不等齒杯口線蟲(chóng)以及伊氏雙齒口線蟲(chóng);另一大類群包括杯冠屬、杯環(huán)屬、冠環(huán)屬

6、、盅口屬和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)、拉氏杯口線蟲(chóng)、雙冠雙冠線蟲(chóng)、頭似輔首線蟲(chóng)。其中冠環(huán)屬、盅口屬和杯冠屬的親緣關(guān)系較近;長(zhǎng)形杯環(huán)線蟲(chóng)和外射杯環(huán)線蟲(chóng)與杯環(huán)屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；贑OⅠ+nad1序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與之類似，僅支持率存在差異。采用ML法重建圓線蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系自展支持率較低，BI法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)支持率高，說(shuō)明依據(jù)COⅠ和nad1序列進(jìn)行圓線蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，BI法更加適合。⑶在河南省發(fā)現(xiàn)卡拉干斯齒線蟲(chóng)（Skrjabinode

7、ntus caragandicus），對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和分子序列測(cè)定與分析。結(jié)果表明:卡拉干斯齒線蟲(chóng)中等大小，口囊壁呈“S”狀，前端極度膨大，厚10～12μm，后端稍薄，約4～6μm，外葉冠由8個(gè)長(zhǎng)而寬的小葉組成，內(nèi)葉冠由16～18個(gè)短而寬的小葉組成，食道漏斗發(fā)達(dá)，雄蟲(chóng)生殖錐長(zhǎng)337μm，引器長(zhǎng)245μm;所測(cè)核糖體DNA(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及5.8S片段長(zhǎng)度為853 bp，其中ITS1長(zhǎng)369 bp，ITS2長(zhǎng)331