一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn).pdf

1、一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn)一體化生物加工過程進(jìn)行大腸桿菌的半纖維素琥珀酸生產(chǎn)EngineeringEscherichiacolifsuccinateproductionfromhemicelluloseviaconsolidatedbioprocessing（國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助NSFC21176182）（國家973計(jì)劃項(xiàng)目資助NO.2011CBA00804，2012CB725203）一級學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)

2、學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：鄭宗寶指導(dǎo)教師：趙學(xué)明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年六月中文摘要中文摘要復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及解聚所需的高成本是阻礙半纖維素作為底物進(jìn)行生物燃料和生物化學(xué)品生產(chǎn)的主要障礙。一體化生物加工過程（ConsolidatedBioprocessingCBP）通過利用一種微生物同時(shí)行使水解酶的生產(chǎn)，生物質(zhì)原料的降解以及生物產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化這三大功能，能夠顯著降低木質(zhì)纖維素原料包括半纖維素利用過程的成本。在本文中，通過借鑒代謝工程與合成生

3、物學(xué)的基本原理與思想，改造大腸桿菌使其表達(dá)分泌三種半纖維素酶，實(shí)現(xiàn)了直接以山毛櫸木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的生物轉(zhuǎn)化過程。木聚糖酶的胞外分泌是通過與OsmY蛋白的融合實(shí)現(xiàn)的。將十二個(gè)不同來源的并與OsmY融合的木聚糖內(nèi)切酶木糖苷酶組合進(jìn)行酶學(xué)表征，選擇出一組具有最優(yōu)酶學(xué)特性的木聚糖酶組合，即來自于FibrobactersuccinogenesS85的木聚糖內(nèi)切酶XynCA以及來自于Fusariumgraminearum的木糖苷酶Xylo

4、A。在該菌株中，木聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)8h時(shí)，即可向胞外分泌0.180.01gl的蛋白質(zhì)，木聚糖內(nèi)切酶活性為12.140.34Umg，木糖苷酶活性為923mUmg。隨后通過一系列措施來進(jìn)一步優(yōu)化木聚糖酶的表達(dá)分泌，以提高其水解效率，更好的滿足CBP生產(chǎn)的需要，包括敲除大腸桿菌Braun’slipoprotein的編碼基因lpp；過表達(dá)催化二硫鍵形成的氧化還原酶編碼基因dsbA；優(yōu)化木聚糖酶表達(dá)載體的表達(dá)水平；通過Blc蛋白于外膜表面展示木糖苷

5、酶；過表達(dá)來自于枯草芽孢桿菌168的阿拉伯糖苷酶編碼基因abf2等。將半纖維素水解能力與一株琥珀酸高產(chǎn)菌進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)了在沒有提供外部木聚糖水解酶及任何有機(jī)組分的情況下直接以木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸的生產(chǎn)。由此構(gòu)建的大腸桿菌菌株Z6373在厭氧條件下以木聚糖為底物，可以得到0.37gg的琥珀酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了以木聚糖酸水解液為底物時(shí)的76%。本文通過表達(dá)和分泌三種半纖維素酶成功的建立起一個(gè)大腸桿菌以木聚糖為底物進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)的CBP系統(tǒng)。本