基于DNA循環(huán)放大技術(shù)的表面增強(qiáng)拉曼散射傳感分析方法研究及在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、本文采用了表面增強(qiáng)拉曼散射分析方法，制備了具有SERS活性的納米金生物條碼探針，構(gòu)建了基于DNA分子機(jī)器和滾環(huán)復(fù)制的循環(huán)放大方法、DNA酶識(shí)別元件引發(fā)的靶替代循環(huán)放大方法、基于引物自產(chǎn)生的雙功能DNA適體循環(huán)放大方法和發(fā)卡DNA適體引發(fā)的循環(huán)放大方法，實(shí)現(xiàn)了基因、腫瘤細(xì)胞、生物活性小分子和蛋白質(zhì)等腫瘤標(biāo)志物高靈敏度、高選擇性檢測(cè)。主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　1.構(gòu)建了一種新型的多重循環(huán)的DNA分子機(jī)器，并首次將表面增強(qiáng)拉曼光譜

2、技術(shù)引入DNA分子機(jī)器循環(huán)中。利用納米金作為增強(qiáng)底物，制備了攜帶有大量拉曼分子的納米金生物條碼作為拉曼信號(hào)探針。以內(nèi)切酶為介導(dǎo)，目標(biāo)DNA引發(fā)了雙重DNA循環(huán)放大反應(yīng)和滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)(RCA)，使信號(hào)顯著增強(qiáng)，并通過磁性分離和洗滌，除去過量的納米金生物條碼，降低了檢測(cè)體系的背景值，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的高靈敏度檢測(cè)?；谶m體DNA對(duì)配體的高特異性識(shí)別和結(jié)合能力，進(jìn)一步通過檢測(cè)癌細(xì)胞考察和驗(yàn)證了該方法的通用性。實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的高靈敏度檢

3、測(cè)，該方法檢測(cè)DNA和淋巴瘤Ramos細(xì)胞的檢測(cè)限分別可達(dá)2.0×10-16 M和8個(gè)細(xì)胞，且成功應(yīng)用于復(fù)雜樣品中腫瘤細(xì)胞的選擇性分析。本方法具有通用性，只需改變DNA適體的序列，即可檢測(cè)不同的腫瘤細(xì)胞或其他腫瘤標(biāo)志物。因此，該方法在腫瘤早期診斷以及基因檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　2.研制了一個(gè)新穎的DNA酶-SERS信號(hào)放大系統(tǒng)用于L-組氨酸的檢測(cè)。DNA酶替代了傳統(tǒng)DNA循環(huán)放大方法中的DNA適體識(shí)別目標(biāo)分子。利用DNA

4、酶和目標(biāo)分子結(jié)合后獨(dú)特的共反應(yīng)催化剪切活性，首次構(gòu)建了基于DNA酶識(shí)別和引發(fā)的雙重循環(huán)放大模式。在靶替代循環(huán)反應(yīng)中，利用靶的再循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)了高效的源頭信號(hào)放大。另外在發(fā)卡DNA循環(huán)反應(yīng)的過程中，固定在磁性微球上的發(fā)卡探針被不斷打開，進(jìn)而與大量的SERS標(biāo)記物生物條碼結(jié)合大量的發(fā)卡，大大提高了L-組氨酸的檢測(cè)靈敏度。在最佳反應(yīng)條件下，檢測(cè)限達(dá)0.56 nM(3σ)，可用于實(shí)際樣品細(xì)胞勻漿中的L-組氨酸的測(cè)定。該方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，靈

5、敏度高且具有良好的選擇性。
　　3.利用適體的結(jié)構(gòu)互變性質(zhì)，制備了新穎的雙功能適體配合物，構(gòu)建了一種基于PS-SDP反應(yīng)平行測(cè)定ATP和溶菌酶的雙功能SERS檢測(cè)方法。該方法以雙功能適體和引發(fā)鏈的互補(bǔ)形成的配合物作為媒介，通過靶結(jié)合后引發(fā)的PS-SDP反應(yīng)和DNA多重循環(huán)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了ATP和溶菌酶的平行靈敏檢測(cè)。ATP和溶菌酶的檢測(cè)限分別達(dá)0.05 nM和10fM。此方法具有靈敏度高、選擇性好、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于人

6、體血清樣品的ATP和溶菌酶測(cè)定。本工作具有廣泛適用性，只需改變DNA適體的序列，即可實(shí)現(xiàn)基因、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞等腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度和高選擇性雙功能平行檢測(cè)，為雙功能生物傳感分析方法供了新的思路和途徑。
　　4.基于發(fā)卡型適體DNA特異性識(shí)別目標(biāo)物和結(jié)構(gòu)互變特性，采用SERS檢測(cè)技術(shù)，首次設(shè)計(jì)了發(fā)卡型適體DNA循環(huán)SERS信號(hào)放大傳感分析方法，用于溶菌酶的檢測(cè)。本方法的原料僅為發(fā)卡型適體DNA、聚合酶、內(nèi)切酶和SERS探針。設(shè)計(jì)了靶

7、替代循環(huán)和發(fā)卡DNA聚合酶鏈剪切循環(huán)模式，相比于較前期DNA酶-SERS信號(hào)放大系統(tǒng)，其放大效率顯著提高。在最佳反應(yīng)條件下，采用溶菌酶為模型，測(cè)得溶菌酶濃度的線性范圍為5.0×10-15～5.0×10-12 M，檢測(cè)限為2fM(3σ)，比前期雙功能循環(huán)放大SERS分析方法檢測(cè)溶菌酶提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且通過選擇性實(shí)驗(yàn)的考察驗(yàn)證了該方法的良好的選擇性。該方法易于合成，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好，在蛋白質(zhì)及其它腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊