基于黃瓜花葉病毒的基因沉默載體優(yōu)化.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員,是世界上寄主范圍最廣的病毒。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)是一快速高效的研究植物基因功能工具。本研究在前人的基礎(chǔ)上,基于CMV-Tsh株系的RNA2構(gòu)建基因沉默載體,選擇不同的指示基因進行沉默效果分析,并成功構(gòu)建CMV的

2、農(nóng)桿菌侵染性克隆。主要內(nèi)容如下:
　　 一、CMV-Fny假重組弱病毒組合的篩選
　　 以CMV-Fny與CMV亞組Ⅰ中不同株系的RNA2(Cb7 RNA2、Can RNA2和Tsh RNA2)構(gòu)建RNA2不同的假重組病毒,接種本氏煙。接種7天后,F1F2F3、F1C2F3、F1CNa2F3在寄主上均引起葉片皺縮、蜷曲的癥狀,而F1Tsh2F3在本氏煙上則引起輕花葉的癥狀反應(yīng),因此以CMV-Tsh RNA2作為構(gòu)建VIG

3、S載體母本。
　　 二、基于CMV-TshRNA2的2b構(gòu)建基因沉默載體
　　 采用PCR以及雙酶切等手段對CMV-Tsh RNA2進行了三種改造,構(gòu)建Tsh的2b基因缺失95nt、完全缺失的TshRNA2,及在2b的終止密碼子后,RNA2的UTR前引入MluⅠ和SnaBⅠ酶切等酶切位點,前兩個載體分別命名為Tsh R23/42b、Tsh R2△2b,而Tsh RNA2的終止密碼子后,RNA2的UTR前直接引入酶切位點構(gòu)

4、建而來的載體則命名為Tsh R22b。pTsh R23/42b、pTsh R2A2b以及pTsh R22b體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別與CMV-Fny RNA1和FnyRNA3混合接種本氏煙,證實假重組病毒具有侵染活性后;在上述的克隆位點分別插入354pb大小的本氏煙PDS片段,體外轉(zhuǎn)錄接種后比較本氏煙的光漂白程度,最終確定pTshR23/42b為本研究的基因沉默載體作為進一步分析對象。
　　 三、不同指示基因沉默效果的研究
　　

5、pTsh R23/42b載體中插入PDS或Su基因部分片段以及綠色熒光蛋白基因(GFP)部分片段,分析寄主的光漂白、葉表黃化和轉(zhuǎn)GFP本氏煙(16c)變紅程度,并采用semi RT-PCR分析靶標(biāo)基因在植株中的表達(dá)量。結(jié)果表明:F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3接種本氏煙后,植株葉表呈現(xiàn)明顯的光漂白,F1Tsh R23/42b-Su351F3誘導(dǎo)本氏煙產(chǎn)生黃化現(xiàn)象,相應(yīng)的植株中PDS和Su的表達(dá)量均下調(diào);在UV lamp照

6、射下,接種F1Tsh R23/42b-GFP217F3的16C植株則呈現(xiàn)發(fā)紅,而接種F1Tsh R2～2bF3植株呈綠色,semi RT-PCR檢測到植株中的GFP表達(dá)量下調(diào)。采用汁液摩擦接種的方法,分析F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3在本氏煙的穩(wěn)定性,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)接15次,F1Tsh R23/42b-NbPDS354F3均能穩(wěn)定存在于寄主中,并使得本氏煙產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象。
　　 四、以啟動子序列和大豆PDS為插入

7、片段的沉默效應(yīng)以及下調(diào)Beclin基因后轉(zhuǎn)NN基因煙草對TMV的癥狀反應(yīng)
　　 在pTsh R23/42b載體中插入本氏煙PDS或GFP的啟動子部分片段、大豆PDS部分片段(分別命名為proPDS、35s、GmPDS)以及Beclin基因部分片段,分析本氏煙的光漂白、16C變紅程度、大豆的光漂白和NN基因煙草對TMV的癥狀反應(yīng)。結(jié)果表明:本氏煙接種F1Tsh R23/42b-proPDS223F3后出現(xiàn)明顯光漂白;16C接種F1

8、Tsh R23/42b-35s120F3后,在UVlamp照射下呈現(xiàn)發(fā)紅;在大豆的PDS被F1Tsh R23/42bGmPDS277 F3被下調(diào)表達(dá)后,植株呈現(xiàn)光漂白表型。轉(zhuǎn)NN基因煙草(本氏煙和三生煙)接種F1Tsh R23/42b-Beclin346F3后,經(jīng)過7天再接種TMV,轉(zhuǎn)NN基因煙草出現(xiàn)系統(tǒng)性壞死,而對照病毒F1Tsh R23/42bF3接種的植株,TMV則引起枯斑癥狀。
　　 五、CMV農(nóng)桿菌侵染性克隆的構(gòu)建以及

9、應(yīng)用
　　 PCR擴增TSh R23/42b、Tsh R23/42b-NbPDS354、Tsh R23/42b-Su351、Fny RNA1、RNA2、RNA3全長序列,目的片段回收后將其克隆至瞬時表達(dá)載體pCB301中,陽性克隆轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。通過農(nóng)桿菌浸潤接種本氏煙,分析農(nóng)桿菌CMV-Fny,F1Tsh R23/42b-NbPDS353F3和F1Tsh R23/42b-PDS353 F3在本氏煙上引起的光漂白和葉表黃