AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵體系構象變化及轉運機理的計算模擬研究.pdf

1、蛋白質是生命現(xiàn)象的主要承載者，是存在最廣泛、最豐富的生物大分子。在生理條件下，不同的氨基酸序列能夠折疊成特定的三維結構，早在上世紀四十年代，人們就已經利用X射線單晶衍射的方法得到了一些蛋白質分子的三維結構。由于X射線單晶衍射得到的結構是靜止的，所以蛋白質分子給人的最初的印象是單一的、剛性的。隨著蛋白質結構測定技術的日益成熟，人們逐漸發(fā)現(xiàn)對于同一個蛋白質分子在不同晶體環(huán)境中得到的結構往往處于不同的構象，而這些構象之間具有大幅度的變化，逐漸

2、認識到蛋白質分子的構象變化對于其生物學功能的重要性。這種現(xiàn)象用物理學家的語言來描述就是蛋白質分子作為一種軟物質，是一個由不同構象組成的龐大系綜，可以用多維勢能面較直觀的描述，勢能面可以給出每個構象的相對分布情況（熱力學）和構象之間轉換的能壘（動力學）。晶體結構只是蛋白質勢能面上的一個點，要全面理解蛋白質的功能和揭示生理過程的分子機制，我們不但需要了解蛋白質的靜態(tài)結構，更需要了解蛋白質結構的柔性和各構象之間的轉換，即其動態(tài)特性。因此需要在

3、傳統(tǒng)的結構生物學研究中加入第四個維度，即時間，這樣就將結構-功能關系擴展到結構-動力學-功能關系的研究。
　　蛋白質分子的構象變化在空間和時間尺度上分布很廣，從快速的局部原子振動、側鏈轉動到慢速的大幅度的結構域的整體運動、蛋白質折疊、變構效應、蛋白質變性。研究蛋白質分子構象變化的實驗手段有很多，如X射線單晶衍射、核磁共振（NMR）、熒光共振能量轉移(FRET)、圓二色光譜(CD)、紅外光譜、拉曼光譜、電子順磁共振等。和實驗手段相比

4、，計算機模擬方法在研究蛋白質動力學方面具有獨特的優(yōu)勢。它可以在原子尺度上對蛋白質分子進行詳細微觀研究，跟蹤體系中每一個原子隨時間的自然演化過程以預測其性質，給出蛋白質、核酸等生物大分子內部運動的最詳實的結果，直接在原子尺度上提供蛋白質分子和其他生物大分子的動態(tài)信息并且可以以此推測動態(tài)運動與生物功能之間的關系。這些都是實驗中很難甚至無法達到的。目前由于計算機計算能力、并行效率以及計算精度的限制，對于μs～ms級的構象變化是很難用普通的全原

5、子的分子動力學模擬的。為了克服這一困難，計算生物學家發(fā)展了多種方法和策略來簡化力場或施加外力以加速構象變化的演化過程。
　　本論文中我們的研究體系是AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵，希望通過計算機模擬的方法研究其構象變化的動力學，增強對其作用機理的認識，揭示其作用過程的分子機理，為藥物的研制、疾病的治療提供更多的信息和理論基礎。
　　多重耐藥性是導致抗感染藥物治療和腫瘤化療失敗的重要原因之一，可以對結構和功能上迥異的多種

6、藥物或對其有毒的代謝產物同時表現(xiàn)出耐受性。多重耐藥性主要是由細菌或腫瘤細胞膜上多重耐藥泵產生的，廣泛存在于自然界中，在革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真核細胞中都可見到。已發(fā)現(xiàn)與多重耐藥性轉運蛋白相關的蛋白超家族主要有5個:ABC(ATP binding cassette)超家族、RND(resistance nodulation division)超家族、MF S(major facilitator superfamily)超家族、MAT

7、E(the multidrug and toxic-compound extrusion)超家族、SMR(smallmultidrug resistance)超家族。其中，RND蛋白在真核和原核細胞中都存在，是一種繼發(fā)性主動轉運蛋白，由質子順電化學梯度的跨膜運動提供能量。目前RND蛋白中研究比較多、比較清楚的體系是來自于大腸桿菌的AcrB蛋白，是大腸桿菌產生多重耐藥性最重要的蛋白之一。
　　AcrB在發(fā)揮其生物功能時需要兩個幫手:

8、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC，這三個蛋白組合成一個轉運復合物AcrAB-TolC。在這個AcrAB-TolC多重耐藥性轉運體系中，AcrB位于細胞內膜，其主要功能是通過質子順電化學梯度的跨膜運動（從細胞周質到細胞質）為整個體系提供能量，以及篩選由細胞質或細胞周質進入的分子，將篩選出的底物分子傳遞給TolC; TolC位于細胞外膜，將底物分子轉運到細胞外;AcrA位于細胞周質中，與AcrB，TolC都有相互作用，對于整個體系的

9、轉運功能必不可少，但其具體作用機理尚不清楚。
　　通過X射線單晶衍射得到的三維結構顯示AcrB以三聚體的形式存在。其中三個單體處于三個不同的構象，即:進入狀態(tài)（A態(tài)），結合狀態(tài)(B態(tài)）和排出狀態(tài)(E態(tài)）。這三個連續(xù)的狀態(tài)似乎暗示了AcrB在轉運底物時構象變化的機理可能是三態(tài)依次循環(huán)(three-step functionally rotating mechanism)，即A→B→E→A的構象依次變化的機理。一些結構和生化實驗的結果

10、在一定程度上支持這一機理，但是都無法直接證實，而且目前關于AcrB的轉運機理還有很多問題亟待解釋。我們首先對AcrB體系做了常規(guī)分子動力學模擬，結果表明在AcrB三聚體中PD結構域，尤其是其中PC2子結構域的構象運動比較明顯;另外我們還發(fā)現(xiàn)在B單體結合口袋有底物結合的情況下，質子化狀態(tài)D407HD408H(E)晶體結構在50ns的模擬中比較穩(wěn)定。但是通過普通分子動力學模擬很難完成AcrB的功能性構象轉換，我們隨后采用了正則模式分析和靶向

11、分子動力學模擬方法對AcrB進行了研究。發(fā)現(xiàn)單體低頻模式中以PD結構域的運動為主，而且低頻模式對構象轉換都有較大的貢獻。AcrB三聚體的正則模式分析表明單體內PD結構域與TMD結構域之間的構象耦合很弱，但是單體之間卻有明顯的構象耦合，另外不同單體之間的PN結構域相關性較強。靶向分子動力學模擬揭示的整個構象轉換(ABE→BEA)過程是從A→B構象變化中PN2子結構域的構象運動開始的，通過三個單體PN子結構域之間的構象耦合傳遞到B和E單體;

12、而PD結構域，尤其是PC2子結構域的內在構象柔性可能為隨后的構象變化提供了熵驅動力，推動整個轉運循環(huán)。我們發(fā)現(xiàn)底物的轉運和質子轉運路徑的構象變化都是在PD結構域中的整體構象運動結束后才開始的，因此質子轉運路徑中局部殘基側鏈的構象變化可能是底物轉運的決速步驟。
　　底物離開AcrB之后，通過TolC外膜蛋白，排到細胞外。TolC外膜蛋白是一個跨膜孔道蛋白，在其晶體結構的構象中，TolC的細胞外端和細胞周質端都處于關閉狀態(tài)，有兩個門徑

13、:細胞外門徑(EG)和細胞周質端門徑(PG）。細胞外門徑是由三個無規(guī)線團(loop)組成的，細胞周質端門徑則是由向內彎曲的α-螺旋束形成的，在入口端的氫鍵和鹽橋網(wǎng)絡使其處于閉合狀態(tài)。為了了解藥物分子通過TolC孔道的自由能途徑，我們計算了鈉離子和阿霉素(doxorubicin，DOX)沿著TolC孔道中軸線坐標的平均力勢(Potential of Mean Force，PMF)，發(fā)現(xiàn)阿霉素和鈉離子通過時，TolC的細胞周質端門徑(PG)

14、的打開都會發(fā)生，而且其打開是由底物決定的。但是這個區(qū)域的構象變化并不會導致鈉離子通過時的能壘。細胞外無規(guī)線團和殘基Lys283會導致鈉離子的滲透能壘，但是由于阿霉素與蛋白之間廣泛的相互作用，阿霉素在這個區(qū)域內并沒有能壘。TolC在鈉離子通過時具有較高的構象柔性，但是阿霉素似乎可以穩(wěn)定其關閉構象。AcrB的存在并不能幫助TolC打開其細胞周質端門徑，而TolC細胞周質端門徑的打開會引起TolC-AcrB復合物的解體。為了采樣到TolC構象

15、空間中更多處于打開狀態(tài)的構象，我們做了各種突變體的分子動力學模擬，發(fā)現(xiàn)采樣空間中的大部分構象都是不對稱的，但是打開程度最大的構象（完全打開構象）卻是對稱的。我們還通過靶向分子動力學模擬方法模擬了由關閉狀態(tài)到打開狀態(tài)的全過程，發(fā)現(xiàn)打開過程中呈現(xiàn)不對稱構象。
　　AcrAB-TolC體系的另一個組成部分是膜融合蛋白AcrA，它是一個鐮刀型、拉長結構的分子，包含四個結構域:α螺旋發(fā)卡結構域(α-hairpin domain)、硫辛結構域

16、(lipoyl domain)、β桶結構域(β-barrel domain)，和近膜結構域(membraneproximal(MP) domain)。目前AcrA蛋白在AcrAB-TolC體系中行使其功能的作用機理還不清楚。AcrA的晶體結構只得到了部分結構域的結構，缺少N端和C端，而且還引入了四個突變。功能實驗表明缺少C端的AcrA和引入四個突變的AcrA對很多底物的耐藥性都消失了。結構研究和順磁共振(EPR)實驗都顯示AcrA具有很

17、高的構象柔性，而且pH可以誘導構象變化。我們以MexA為模板通過同源建模構建了AcrA的完整結構，在不同pH值的條件下做了全原子分子動力學模擬，結果表明兩個模型的結構域內部都很穩(wěn)定，構象柔性主要來自于α-hairpin和MP結構域的整體構象運動。AcrA的構象對局部突變和pH值都很敏感。與EPR實驗結果一致，我們發(fā)現(xiàn)將pH值由7.0降低到5.0會限制AcrA結構域之間的構象運動，而His285的質子化狀態(tài)會改變局部的氫鍵相互作用，調節(jié)p

18、H引起的構象變化?；贏crB、TolC的晶體結構和AcrA的完整結構模型，我們通過分子對接得到了AcrAB-TolC復合物的結構模型，并對該模型做了正則模式分析，結果表明在AcrB和TolC沒有直接接觸的結構之間也會有構象的耦合，而AcrA的加入會顯著增強AcrB和TolC的構象耦合。
　　我們對AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵體系的構象柔性和底物轉運機理進行了系統(tǒng)和全面的研究，在原子水平上提供了底物轉運過程中AcrAB-T