IA型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及相關蛋白質(zhì)復合物結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)各種功能的直接執(zhí)行者，大多數(shù)重要的細胞生命過程的執(zhí)行與完成，都是由蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)復合物調(diào)節(jié)控制。蛋白質(zhì)復合物大多是由大量獨特的蛋白質(zhì)組合而成的。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu)解析及功能研究是闡明細胞代謝、信號傳導和基因表達等重要生命過程的關鍵步驟環(huán)節(jié)。因此，對蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu)解析和功能研究具有生物學和治療學的雙重意義和價值。
　　 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一種磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸

2、鹽肌醇環(huán)上3號位的脂質(zhì)激酶，由此產(chǎn)生的磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸鹽在一系列信號傳導過程中發(fā)揮著重要的作用。PI3Ks由三種不同結(jié)構(gòu)和功能的酶構(gòu)成(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，其中IA型PI3K是有兩個亞基組成的異二聚體。催化亞基p110有三個異形體:α、β、δ，其中α和β異形體大量存在于哺乳動物細胞中;調(diào)節(jié)亞基(p85α、p85β、p55α、p50α、p55γ)與p110形成穩(wěn)定的二聚體，以保證其熱穩(wěn)定性并抑制其活性。目前，雖然已有部分片段的結(jié)構(gòu)報

3、道，IA型PI3K的整體結(jié)構(gòu)仍舊未知。因此其調(diào)節(jié)亞基和催化亞基各自的結(jié)構(gòu)仍需進一步研究，p85二聚體的結(jié)構(gòu)也需進行研究，這樣才能更好地解析蛋白質(zhì)復合物p85/p110的整體結(jié)構(gòu)。
　　 同時，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能存在著一定的關聯(lián)，觀察其結(jié)構(gòu)的變化有助于推斷分析對其功能的影響。因此，建立構(gòu)效關系研究方法有助于深入了解蛋白質(zhì)的作用并促進其結(jié)構(gòu)研究進展。
　　 本論文以分析化學、環(huán)境毒理學為背景，結(jié)合高效液相色譜、質(zhì)譜等實驗技

4、術，利用γ射線產(chǎn)生羥基自由基對蛋白質(zhì)進行氧化標記，并結(jié)合現(xiàn)代生物技術和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);結(jié)合光譜技術和分子對接模擬方法，對選定的功能蛋白酶進行蛋白質(zhì)功能（酶活性）的研究。論文主要包括以下五個部分的內(nèi)容:
　　 論文的第一章概述了蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)情況;闡述了磷脂酰肌醇-3-激酶的構(gòu)成和功能以及目前對其結(jié)構(gòu)研究的現(xiàn)狀和進展;介紹了蛋白質(zhì)氧化標記分析技術、蛋白質(zhì)分離和鑒定技術以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析等多種技術手段。在文獻

5、綜述的基礎上分析了目前研究中存在的問題和需要調(diào)整之處，并提出利用γ射線照射產(chǎn)生羥基自由基對蛋白質(zhì)復合物形成前后蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈進行氧化標記、聯(lián)合蛋白酶解和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術解析p85/p110α的結(jié)構(gòu)的方法。
　　 論文的第二章選擇p85兩個相連的結(jié)構(gòu)域片段——nSH2-iSH2進行結(jié)構(gòu)解析:對nSH2片段和nSH2-iSH2片段設置不同的暴露照射時間進行羥基自由基氧化標記，使用胰蛋白酶分別將氧化標記的蛋白酶解，對nSH

6、2和nSH2-iSH2酶解產(chǎn)物進行液相色譜分離、質(zhì)譜分析檢測，確定氧化標記程度，并對同一個肽氧化標記前后的標記程度進行比較，最終確定氧化標記程度降低的多肽為nSH2和iSH2的結(jié)合位置——多肽(351-360)DTADGTFLVR、(392-426)YGFSDPLTFSSVVELINHYR和(426-436)LLYPVSK。
　　 論文的第三章解析了p85二聚體p85-p85的結(jié)構(gòu)，解析方法與上一章相似。通過酶解氧化標記的p85

7、單體和p85二聚體，并利用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術作為主要檢測技術，定性、定量檢測氧化標記前后同一個肽在單體和二聚體中氧化標記程度的變化，最終確定p85二聚體的結(jié)合位置位于SH3和BCR區(qū)域，具體涉及多肽(21-36)EEDIDLHLGDILTVNK、(37-68)GSLVALGFSDGQEARPEEIGWLNGYNETTGER、(106-136)TEADVEQQALTLPDLAEQFAPPDIAPPLLIK和(137-143)LVEAI

8、EK等幾個位點。
　　 論文的第四章利用光譜學方法探索蛋白質(zhì)的構(gòu)效關系，重點研究其結(jié)構(gòu)變化對功能的影響。在模擬生理的條件下，選取對蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生毒性影響的物質(zhì)（本文選取一種持久性有機污染物——農(nóng)藥三氯殺螨醇）和功能蛋白（兩種絲氨酸蛋白酶——胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶），利用紫外吸收光譜、熒光光譜和同步熒光光譜等光譜學技術手段定性定量地研究小分子化合物對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響及其作用機理，進而分析結(jié)構(gòu)變化所引起的蛋白質(zhì)功能的改變，

9、并通過分子模擬等手段具體分析作用位點、作用力等相互作用信息。通過多種技術方法檢測和分析，確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對其功能的影響，建立研究蛋白質(zhì)構(gòu)效關系的光譜學方法。
　　 論文的第五章對本文的三個研究主體部分進行了總結(jié)論述，并對這種新的解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的方法做了展望。
　　 本研究豐富了蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復合物結(jié)構(gòu)解析的方法，評價了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對其功能的影響，有助于蛋白質(zhì)組學領域的研究與發(fā)展，并為相關疾病的預防、早期診斷和治