Hr基因敲除小鼠的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　無毛基因（Hairless,Hr)是一個含有鋅指結(jié)構(gòu)并與毛發(fā)生長密切相關(guān)的一個基因，該基因編碼一個高表達于皮膚和腦部的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控甲狀腺受體的轉(zhuǎn)錄，基因產(chǎn)物作用于毛囊細胞，控制著毛囊細胞的增殖、分化與細胞凋亡之間的平衡，在毛囊中的表達具有周期性，從而影響毛發(fā)的生長周期轉(zhuǎn)換，無毛基因的缺失導(dǎo)致毛囊再生受到阻礙，引發(fā)形成一種復(fù)雜的皮膚表型[1-4]。無毛基因的突變是于1924年首次在小鼠身上被發(fā)現(xiàn)[5]，無毛基因突變

2、引發(fā)的小鼠的皮膚和被毛的形態(tài)發(fā)生異常，造成小鼠毛發(fā)脫落，但是Hr突變小鼠在出生后第一次的毛囊形成和毛發(fā)的表型都是正常的。目前對毛發(fā)生物學(xué)的研究，我們難以知道毛發(fā)的形態(tài)發(fā)生到底是怎樣的機制，哪些因子對毛發(fā)具有真正的調(diào)控作用。本課題通過構(gòu)建Hr基因敲除小鼠模型研究毛發(fā)生長脫落的作用機制，對基因的功能和蛋白質(zhì)表達水平方面的實驗結(jié)果進行分析，揭示出毛發(fā)的生長調(diào)控受相關(guān)基因表達水平變化的影響。
　　研究方法：
　　1.利用 TALEN

3、基因修飾技術(shù)構(gòu)建 Hr基因敲除小鼠模型，提取子代小鼠DNA、PCR擴增、測序、陽性鑒定，Hr基因敲除小鼠品系穩(wěn)定繁育；
　　2.構(gòu)建成功的 Hr基因敲除純合子小鼠作為主要實驗對象,觀察記錄不同日齡Hr基因敲除小鼠的形態(tài)學(xué)和皮膚組織學(xué)切片病理變化；
　　3.取不同日齡的Hr基因敲除純合子小鼠和野生型小鼠的背部皮膚組織為實驗材料，IHC法探究Hr突變基因在毛囊結(jié)構(gòu)中的表達部位，RT-PCR和Western blot法檢測mRNA

4、和HR的表達水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.本實驗室成功構(gòu)建兩種Hr基因敲除小鼠模型，第一種是Hr編碼序列的86-87位缺失兩個堿基GT，第二種敲除小鼠品系是88-89位點AC堿基缺失，本實驗室現(xiàn)已穩(wěn)定繁育出這兩種Hr基因敲除品系小鼠，其遺傳特征遵循孟德爾遺傳定律。
　　2.敲除純合子小鼠出生后約兩周，毛發(fā)從腹部開始脫落，頭部和背部毛發(fā)稀疏并逐漸脫凈，終生不再長毛，兩種敲除品系純合子小鼠的毛發(fā)表型相似，但是Hr基因敲除

5、雜合子小鼠毛發(fā)表型正常；基因敲除純合子小鼠21日齡時的皮膚組織中毛囊結(jié)構(gòu)解體，28日齡皮下組織開始形成小的包囊結(jié)構(gòu)，6月齡的小鼠皮膚組織中無規(guī)則排列著大小不等的包囊。
　　3.通過IHC檢測HR的表達部位，結(jié)果顯示21日齡、28日齡、6月齡基因敲除小鼠毛發(fā)的皮膚組織中均明顯可見 HR表達，野生型小鼠僅處于休止期的毛囊結(jié)構(gòu)中有表達，其它時期僅有少量表達。
　　4.實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達量與Western blot

6、檢測的蛋白表達水平一致，基因敲除小鼠(KO)與野生型小鼠(WT)出生后7天（P7）和21天Hr的表達差異不顯著（P>0.05），14天KO的Hr的表達量明顯高于WT，差異顯著(P<0.05)，28天時KO的Hr表達與21天相比無明顯變化，28天時WT的Hr表達量顯著低于KO（P<0.05）。敲除純合子小鼠皮膚組織中Hr在脫毛期均高水平表達，而野生型小鼠的毛囊結(jié)構(gòu)僅處在毛發(fā)休止期時表達較高，實驗結(jié)果分析可知Hr的表達水平調(diào)控毛發(fā)的生長發(fā)育

7、機制。
　　研究結(jié)論：
　　1.Hr基因的敲除可以導(dǎo)致毛發(fā)生長異常，構(gòu)建的 Hr基因敲除小鼠遺傳背景比較清楚，可以被用來作為研究某些皮膚疾病、毛發(fā)疾病及其衰老機制的動物模型。
　　2. Hr敲除小鼠毛發(fā)脫落的皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的病理變化，在脫發(fā)階段小鼠的毛囊結(jié)構(gòu)退化瓦解；Hr基因正常功能的缺失導(dǎo)致毛囊重新形成過程受阻，引起毛發(fā)生長異常。
　　3. HR的表達參與調(diào)控毛發(fā)的生長發(fā)育機制，Hr突變體小鼠皮膚組織中HR高