高效液相色譜測(cè)定血漿中氨基酸的方法學(xué)研究及臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 1.建立一種同時(shí)測(cè)定血漿中色氨酸（tryptophan，Trp）與犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）的高效液相色譜程序波長(zhǎng)設(shè)計(jì)紫外檢測(cè)方法（HPLC-VWD））。
　　 2.用HPLC-VWD內(nèi)標(biāo)法測(cè)定正常人和慢性乙肝患者血漿中Trp與Kyn濃度，探討乙肝患者Trp代謝的變化。
　　 3.建立一種柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FD）同時(shí)測(cè)定血漿中谷胱甘肽（glutathione，

2、GSH）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、半胱氨酰甘氨酸（cysteinylglycine，CysGly）四種硫醇物濃度并對(duì)它們各自的總量、還原型和游離型分別定量。
　　 4.用所建立的HPLC-FD法測(cè)定正常人和尿毒癥患者透析前后GSH、Cys、Hcy和CysGly四種硫醇物的總量、還原型和游離型濃度。利用主成份分析（principal components analys

3、is，PCA）研究尿毒癥患者透析前后血漿硫醇物的代謝；利用偏最小二乘法判別分析（partialleast-squares discriminant analysis，PLS-DA）及其載荷圖研究血漿硫醇物對(duì)尿毒癥的診斷能力。
　　 方法：
　　 1.以3-硝基酪氨酸（3-nitro-tyrosine，3-N-Tyr）為內(nèi)標(biāo)，采用AgilentHypersil ODS（125.0 mm×4.0 mm，5μm）分離。流動(dòng)相為

4、醋酸緩沖液（15 mmol/L，pH5.5）：乙腈為94：6（v/V）：流速為0.8 mL/min；柱溫：25℃；紫外程序化檢測(cè)波長(zhǎng)：0～4.0 min，360 nm；4.1～5.0 min，302nm。用此方法測(cè)定15例正常人和15例慢性乙肝患者血漿中Trp與Kyn。
　　 2.以tris-（2-carboxylethyl）-phosphine（TCEP）為還原劑，N-（1-pyrenyl）maleimide（NPM）為衍生劑

5、，采用Agilent Hypersil ODS（250.0mm X4.0 mm，5μm）分離。流動(dòng)相A：15 mmol/L醋酸鹽溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為水溶液（300 ml水中加入1ml醋酸和1ml磷酸），梯度洗脫。柱溫：25℃，流速：0.5 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，熒光波長(zhǎng)380 nm，進(jìn)樣量：20μl。用所建立的方法檢測(cè)28例健康人和29例尿毒癥患者血液透析前后血漿中總量、游離型和還原型GSH、Cys、

6、Hcy、CysGly濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1.Kyn與Trp的保留時(shí)間分別為2.9 min和4.4 min，線(xiàn)性范圍分別為0.442/μmol/L～18.3μmol/L和3.67μmol/L～470/μmol/L，檢測(cè)限分別為0.014/μmol/L和0.122μmol/L。Kyn與Trp的日內(nèi)變異均小于3％，日間變異均小于4％。平均回收率均在92.29％與104.4％之間。慢性乙肝組Kyn/Trp明顯高于對(duì)照組。

7、
　　 2.GSH、Cys、Hcy和CysGly總量的線(xiàn)性范圍分別為2.00～80.0μmol/L，10.0～1500μmol/L，1.00～120μmol/L，3.00～240μmol/L，r為0.9990～0.9999，具有良好的相關(guān)性。GSH、Cys、Hcy和CysGly還原型的線(xiàn)性范圍分別0.10～8.00μmol/L，1.25～50.0μmol/L，0.01～4.00μmol/L，0.05～6.00μmol/L，r為O

8、.9992～0.9996，具有良好的相關(guān)性。最低檢測(cè)限為0.005～3.0μmol/L。所測(cè)硫醇物濃度，日內(nèi)精密度不超過(guò)5.0％，日間精密度均小于9.0％。平均回收率為80％～115％。
　　 3.①尿毒癥患者透析前血漿中Hcy、Cys和、CysGly總量、游離和還原型濃度高于正常組，GSH總量、游離和還原型濃度低于正常組。
　　 ②尿毒癥患者透析后血漿中各種形式的GSH均較正常組低?？偭颗c游離型Cys透析后降至正常，但

9、還原型Cys仍高于正常。Hcy總量和還原型透析后降至正常但游離型高于正常。透析后各種形式的CysGly濃度均高于正常組。
　　 ③尿毒癥患者血漿總量、游離和還原型Cys和Hcy濃度透析后比透析前分別降低?？偭緾ys和Hcy濃度分別降低了56.5％、53.6％；游離型Cys和Hcy濃度分別降低了81.5％、48.1％；還原型Cys和Hcy濃度分別降低了23.8％、51.9％。血漿總量、游離和還原型GSH和CysGly濃度透析前后無(wú)

10、明顯變化。
　　 ④主成分得分圖顯示透析前與透析后和正常組基本區(qū)分，透析前相對(duì)分散，透析后相對(duì)集中且更接近于正常組。
　　 ⑤運(yùn)用PLS-DA模型診斷尿毒癥透析前患者，正確率為93.1％；診斷透析后患者，正確率為82.8％；其總的判對(duì)率為89.3％。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究建立了一種HPLC-VWD檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定血漿中Kyn和Trp，采用內(nèi)標(biāo)法定量。本方法操作簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短，內(nèi)源性物質(zhì)干擾小，特

11、異性好，準(zhǔn)確度高，適合于臨床檢驗(yàn)。
　　 2.本文建立了以NPM為衍生劑，TCEP為還原劑的硫醇物柱前衍生熒光檢測(cè)法。該方法不僅可同時(shí)測(cè)定tGSH、tCys、tHcy和tCysGly，還可測(cè)定他們各自的游離型和還原型。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏。
　　 3.本研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者硫醇物的代謝發(fā)生了紊亂。透析對(duì)尿毒癥患者硫醇物的代謝紊亂的糾正有明顯效果。建立PLS-DA模型能很好的判別透析前患者、透析后患者和正常對(duì)照組。載荷圖表