基于核酸擴(kuò)增技術(shù)與納米材料的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建.pdf

1、隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展，人們對(duì)于健康、糧食等關(guān)乎生存的問題越來越重視，而探究這些問題往往是通過檢測(cè)的手段進(jìn)行的，因此對(duì)于檢測(cè)技術(shù)的要求愈來愈高。生物體內(nèi)的核酸，受制于其低的濃度，通常不能直接進(jìn)行定量檢測(cè)，因此電化學(xué)生物傳感器作為一種靈敏的、特異性高的檢測(cè)技術(shù)在核酸的定量檢測(cè)方面受到了研究者的關(guān)注。納米技術(shù)的飛速發(fā)展，已可制備具有可控尺寸、形狀和獨(dú)特理化性質(zhì)的納米材料。功能化的納米材料不僅具有大的比表面積，固載更多的信號(hào)分子和探針;甚至可

2、以作為催化劑催化信號(hào)分子，放大信號(hào)，因此被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器中。
　　本論文在選擇合適的核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)大核酸目標(biāo)物的同時(shí)，結(jié)合功能化的納米材料，構(gòu)建信號(hào)雙重放大的電化學(xué)生物傳感器，以實(shí)現(xiàn)對(duì)于目標(biāo)物的高特異性、超靈敏檢測(cè)。具體內(nèi)容如下:
　　1.結(jié)合鎖式探針指數(shù)級(jí)滾環(huán)擴(kuò)增與CoFe2O4納米粒子檢測(cè)miR-21的電化學(xué)生物傳感器的制備
　　在該報(bào)告中，通過結(jié)合基于鎖式探針指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(padlock probe-

3、based exponential rolling circle amplification，P-ERCA)和CoFe2O4磁性納米顆粒(CoFe2O4MNPs)的納米電催化構(gòu)建了用于檢測(cè)miR-21的超靈敏電化學(xué)生物傳感器。將納米催化劑(CoFe2O4MNPs)和氧化還原分子(Tb)共同固定在石墨烯(Gra)表面上并形成Au@CoFe2O4/Tb-Gra探針，制得的探針通過減少CoFe2O4MNPs和Tb之間的相互作用距離，展示出了C

4、oFe2O4MNPs對(duì)Tb高性能的催化，放大了檢測(cè)信號(hào)。同時(shí)，使用P-ERCA對(duì)于miR-21進(jìn)行擴(kuò)增，在多次聚合和酶切反應(yīng)后，得到大量的P-ERCA擴(kuò)增產(chǎn)物，提高了檢測(cè)物含量，可進(jìn)一步提高生物傳感器的靈敏度。所制備的生物傳感器對(duì)于miR-21在1fM至2nM范圍顯示出良好的線性關(guān)系，且具有低至0.3fM的檢測(cè)限，表現(xiàn)出了高特異性和靈敏性。
　　此外，根據(jù)檢測(cè)物設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針序列，所提出的測(cè)定方法便可用于其它miRNA或DNA的檢

5、測(cè)，具有通用性。
　　2.基于RT-PCR與金納米星/石墨烯/沉積金納米復(fù)合物檢測(cè)小麥CYP707A1基因的電化學(xué)生物傳感器的制備
　　基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器是當(dāng)下研究的熱門，而作為效率高、特異性強(qiáng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)卻很少被應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器中。因此，提出了一個(gè)基于RT-PCR的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)小麥的8'-羥化酶（CYP707A1）基因。該方案使用分別在5'端修飾了生物素和巰基的

6、單鏈DNA作為PCR的上下游引物并對(duì)目的基因CYP707A1進(jìn)行擴(kuò)增，并向擴(kuò)增物中加入氧化還原分子硫堇。使用鏈霉親和素修飾的磁珠通過鏈霉親和素與生物素的強(qiáng)作用力對(duì)擴(kuò)增出的功能化的DNA片段進(jìn)行分離、富集，形成生物耦合物(Thi-DNA@SA-MB)。再將其孵育到金納米星/石墨烯/沉積金修飾的玻碳電極(AuNs/Gra/DpAu/GCE)表面進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用于分離富集DNA片段的鏈霉親和素磁珠對(duì)于氧化還原分子(Thi)具有電催化作