基于納米材料和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器的研究.pdf

1、在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析和病原微生物研究等領(lǐng)域，快速、簡(jiǎn)單、靈敏的實(shí)現(xiàn)生物分子的檢測(cè)，是目前分析化學(xué)中極具吸引力的熱門(mén)研究課題之一。電化學(xué)生物傳感器由于其簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高和易于微型化等優(yōu)勢(shì)在生物分子檢測(cè)上得到了大力的開(kāi)發(fā)和研究。關(guān)注電化學(xué)生物傳感器中的新方法和新技術(shù)，利用多種特異性好的分子識(shí)別元件，結(jié)合性能優(yōu)異的各種新型納米材料，引入有效的信號(hào)放大策略，對(duì)提高電化學(xué)生物傳感器的各項(xiàng)性能，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種生物分子特異靈敏的檢測(cè)具有十

2、分重要的意義。本論文基于多種放大策略，結(jié)合功能化納米材料和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在研發(fā)成本低、實(shí)用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的高靈敏生物傳感器上做了以下工作：
　　1.卟啉錳-DNA雙鏈復(fù)合物引導(dǎo)聚苯胺原位沉積用于凝血酶的電化學(xué)檢測(cè)
　　有文獻(xiàn)報(bào)稱卟啉錳-DNA雙鏈復(fù)合物（MnTMPyP-dsDNA）是一類(lèi)優(yōu)異的過(guò)氧化物模擬酶，但是到目前為止，以MnTMPyP-dsDNA為催化劑催化苯胺聚合為聚苯胺（PANI）的文獻(xiàn)還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)提出

3、以有過(guò)氧化物模擬酶作用的MnTMPyP-dsDNA復(fù)合物為有效的催化劑和模板，在電極表面原位催化生成PANI為電化學(xué)活性物質(zhì)，構(gòu)建電化學(xué)傳感器用于凝血酶（TB）的靈敏檢測(cè)。在構(gòu)建的“夾心型”適體傳感器上，高密度的MnTMPyP-dsDNA催化單元能夠催化苯胺氧化形成聚苯胺，從而產(chǎn)生一個(gè)可測(cè)量的電化學(xué)信號(hào)。為了進(jìn)一步放大電流信號(hào)，聚多巴胺和納米金功能化的Pd@Pt合金納米籠被用作納米載體用于增強(qiáng)生物分子的固載量，為電子轉(zhuǎn)移提供良好的微環(huán)境

4、。因此，擁有免標(biāo)記、良好催化性能和穩(wěn)定性的MnTMPyP-dsDNA復(fù)合物，結(jié)合納米材料顯著的信號(hào)放大能力，所構(gòu)建的傳感器在0.5 pmol/L~30 nmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)凝血酶表現(xiàn)出了良好的線性響應(yīng)，檢測(cè)限達(dá)0.14 pmol/L。
　　2.基于多功能的卟啉鐵摻雜金屬有機(jī)框架材料構(gòu)建的電化學(xué)凝血酶適體傳感器
　　通過(guò)將卟啉鐵（hemin）摻雜到納米粒徑的Fe-MIL-88金屬有機(jī)框架材料中，合成了一種新型的多功能金屬有

5、機(jī)框架材料（hemin@MOFs），并且在酶輔助信號(hào)放大的作用下首次將其用于構(gòu)建電化學(xué)凝血酶適體傳感器。納米金功能化的hemin@MOFs材料（Au/hemin@MOFs）不僅同時(shí)可作為電化學(xué)活性物質(zhì)和固態(tài)的電化學(xué)催化劑，還可以被用作于理想的固載平臺(tái)，固載大量的生物分子。在構(gòu)建的適體傳感器中，葡萄糖氧化酶（GOD）和凝血酶第二適體鏈（TBA II）固載于Au/hemin@MOFs納米材料上形成第二適體耦合物（Au/hemin@MOFs-

6、TBA II-GOD耦合物）。凝血酶夾心于Au/hemin@MOFs-TBA II-GOD耦合物和組裝在電極表面的凝血酶第一適體鏈之間。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并伴隨著H2O2的生成。在電極表面所產(chǎn)生的H2O2被hemin@MOFs進(jìn)一步催化還原，以放大hemin@MOFs自身包含的hemin的電化學(xué)信號(hào)。因此，所合成的hemin@MOFs集催化劑，電化學(xué)活性物質(zhì)和固載平臺(tái)三種不同功能于一體，可作為多功能材料的典范。通過(guò)這樣

7、的巧妙設(shè)計(jì)，該適體傳感器在凝血酶濃度為0.1 pmol/L～30 nmol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng)，檢測(cè)限達(dá)0.068 pmol/L。
　　3.基于β-環(huán)糊精-二茂鐵主客體識(shí)別作用的多肽電化學(xué)生物傳感器的研究
　　我們通過(guò)聯(lián)合二茂鐵（Fc）與β-環(huán)糊精（β-CD）的主客體識(shí)別作用發(fā)展了一種“信號(hào)增強(qiáng)型”（signal-on）的基于多肽剪切的分析方法用于靈敏特異地檢測(cè)前列腺特異性抗原（PSA）。首先，將一段標(biāo)記了氧化還原探針

8、二茂鐵（Fc）的能夠被 PSA特異性識(shí)別剪切的多肽（Fc-peptide）組裝于金包四氧化三鐵磁珠（Fe3O4@Au）表面，在目標(biāo)物存在的條件下，PSA能夠特異性的剪切多肽，帶有多肽碎片的氧化還原探針Fc就會(huì)從Fe3O4@Au表面釋放到溶液中。固載在電極表面的β-CD分子能夠?qū)⑨尫诺饺芤褐械腇c通過(guò)主客體識(shí)別作用捕獲到電極表面，從而產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)用于PSA的定量檢測(cè)。另外，采用碳納米管-樹(shù)枝狀聚氨基胺納米雜化材料（CNTs-PAMAM）

9、用于傳感器敏感界面的構(gòu)建，不僅能夠增加β-CD的固載量用于捕獲剪切釋放的Fc，而且還能促進(jìn)Fc與電極之間的電子傳遞。通過(guò)多肽剪切與主客體識(shí)別作用相結(jié)合，這個(gè)工作提供了一種簡(jiǎn)單的、高靈敏、高特異性的PSA檢測(cè)方法。該傳感器線性范圍為0.001~30 ng/mL，檢測(cè)限為0.78 pg/mL。
　　4. pH計(jì)結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于家蠶微孢子蟲(chóng)基因DNA PTP1檢測(cè)的研究
　　近年來(lái)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一種新興的

10、微生物疾病快速診斷的早期檢測(cè)和識(shí)別工具。目前，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)主要是基于擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳，焦磷酸鎂的濁度，金屬離子的阻抗以及電化學(xué)試劑的電化學(xué)信號(hào)，但是這些技術(shù)由于對(duì)大型昂貴實(shí)驗(yàn)儀器的依賴或不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)等缺點(diǎn)而不被公眾所廣泛接受。這里，我們提出一種通過(guò)使用pH計(jì)直接測(cè)量LAMP擴(kuò)增過(guò)程中釋放的氫離子的集放大和測(cè)定于一體的檢測(cè)方法。并且首次將這種LAMP-pH計(jì)策略用于家蠶微孢子蟲(chóng)的基因DNA的檢測(cè)。這種方法的核心概念是用

11、pH計(jì)將LAMP擴(kuò)增過(guò)程中由于核酸聚合反應(yīng)產(chǎn)生的氫離子引起的pH的變化，以可靠的信號(hào)輸出方式記錄下來(lái)，通過(guò)pH的變化值間接反映核酸的擴(kuò)增程度。通過(guò)這個(gè)平臺(tái)，可以檢測(cè)到0.5 pg/μL的家蠶微孢子蟲(chóng)的基因DNA。此外，該方法簡(jiǎn)單、有效，將有望推廣于不發(fā)達(dá)國(guó)家的農(nóng)民使用。
　　5.追蹤環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中產(chǎn)生的磷酸根離子用于電化學(xué)檢測(cè)家蠶微孢子蟲(chóng)基因DNA PTP1
　　通常情況下，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）中擴(kuò)增出的DNA檢測(cè)都

12、是基于復(fù)雜的凝膠電泳或昂貴的熒光方法。在本文中，與傳統(tǒng)的直接檢測(cè)擴(kuò)增DNA的方法不同，我們通過(guò)電化學(xué)的方法間接追蹤LAMP中產(chǎn)生的磷酸根離子（Pi）實(shí)現(xiàn)核酸的高靈敏檢測(cè)。焦磷酸根離子（PPi）作為L(zhǎng)AMP中核酸聚合反應(yīng)的副產(chǎn)物，被預(yù)先加入的耐高溫?zé)o機(jī)焦磷酸酶（PPase）水解成Pi。因此LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中總的Pi的量是與加入的初始目標(biāo)DNA模板成比例的。水解得到的Pi可以與酸性鉬酸鹽反應(yīng)，在電極表面形成可直接作為電化學(xué)活性物質(zhì)，給出易測(cè)