壬基酚降解酶的分離純化及其表征研究.pdf

1、壬基酚(Nonylphenol，NP)作為一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對(duì)動(dòng)植物的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。環(huán)境中NP的消除，特別是NP的生物降解，近年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，不少學(xué)者在自然界中篩選到了對(duì)NP有降解作用的菌株，而NP降解酶的提取及其性質(zhì)分析卻少有報(bào)道。本論文旨在從菌株P(guān)seudomonas putidaX-8中分離純化出一種NP降解酶，研究其酶學(xué)特性，并探索NP的生物降解途徑。
　　 將本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏

2、的菌株P(guān)seudomonas putida X-8在NP-尿素培養(yǎng)基中30℃震蕩培養(yǎng)26 h，4℃下8000 r/min離心收集菌體，超聲波破壁得到粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析、透析脫鹽、Sephadex G-200分子篩柱層析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析得到凝膠電泳均一的NP降解酶。SDS-PAGE結(jié)果表明，該酶分子量為37 kDa。
　　 以4-NP為底物，分析了NP降解酶的酶學(xué)性質(zhì)，其最佳作用

3、條件為：30℃、pH7.0。在pH值為7.0～10.0，溫度在10～50℃時(shí)，該酶十分穩(wěn)定。測(cè)出該酶的Km值為24.9 mmol/L。測(cè)定了部分金屬離子和化合物對(duì)NP降解酶活性的影響。鎂離子和鈣離子可以提高酶的活力；銅離子對(duì)酶有明顯的抑制作用，低濃度時(shí)即完全抑制酶的活性；其它金屬離子對(duì)酶的活性均有一定程度的抑制作用。金屬螯合劑EDTA在溶液中可起絡(luò)合劑的作用，使酶的活性受到一定的抑制，濃度較低時(shí)抑制作用不明顯，而當(dāng)EDTA含量達(dá)到20

4、mmol/L時(shí)，酶活僅為對(duì)照組的12％。陰離子表面活性劑SDS和還原劑二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)NP降解酶的酶活力有一定的抑制作用。丙烯酰胺不會(huì)影響蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，對(duì)NP降解酶的活性影響很小。低濃度的碘化鉀對(duì)NP降解酶的酶活力的影響不大，當(dāng)?shù)饣浀臐舛冗_(dá)到800 mmol/L時(shí)，則對(duì)NP降解酶有完全的抑制作用。
　　 探討了NP的生物降解途徑。用紫外可見(jiàn)分光光度法分析了4-NP的降解，4-NP在降解3天以后，去除率超過(guò)73％，同時(shí)

5、根據(jù)紫外掃描光譜圖推斷出粗酶對(duì)4-NP的降解途徑并非間位開環(huán)，而是鄰位開環(huán)。用GC-MS法測(cè)定了4-NP降解過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物及最終產(chǎn)物。根據(jù)紫外可見(jiàn)分光光度法、GC-MS法測(cè)定的結(jié)果，推斷出了4-NP可能的微生物降解途徑：4-NP在粗酶的作用下，通過(guò)烷基鏈的斷裂，主要生成兩種中間產(chǎn)物：4-辛基酚和4-丙基酚，然后進(jìn)一步通過(guò)鄰位開環(huán)反應(yīng)，生成CO2和H2O等小分子物質(zhì)。
　　 本研究所分離得到了一種活力強(qiáng)、在常溫下催化反應(yīng)速度