gpc基礎(chǔ)知識(shí)

1、1,GPC基礎(chǔ)知識(shí),島津國際貿(mào)易(上海)有限公司分析中心,2,SEC定義,SEC全稱Size Exclusion Chromatography(體積排阻色譜，或者尺寸排阻色譜）SEC定義：是利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來分離的液相色譜方法。,3,SEC分類,凝膠滲透色譜 (GPC)主要用于聚合物領(lǐng)域以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相(氯仿，THF，DMF)常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物凝膠

2、過濾色譜 (GFC)主要用于生命科學(xué)領(lǐng)域以水溶液為流動(dòng)相常用固定相填料：親水性有機(jī)凝膠(葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺等),4,GPC用途,高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本的參數(shù)之一。高聚物的許多性質(zhì)是與分子量有關(guān)的。例如沖擊強(qiáng)度、模量、拉伸強(qiáng)度、耐熱、耐腐蝕性都與高聚物的分子量和分子量分布有關(guān)。,5,GPC分離原理,固定相是多孔填料，小分子樣品可以進(jìn)入孔徑內(nèi)部樣品與固定相之間無作用力遷移時(shí)間不同,6,MW與RT之間的關(guān)系,,

3、,,,,Log (MW),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,排阻極限,,滲透極限,,GPC柱,7,GPC術(shù)語,排阻極限排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。隨固定相不同，排阻極限范圍約在 400至60×

4、106之間。滲透極限能夠完全進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最大分子的分子量。在選擇固定相時(shí)，應(yīng)使欲分離樣品粒子的相對(duì)分子質(zhì)量落在固定相的滲透極限和排阻極限之間。,8,平均分子量計(jì)算公式,數(shù)均分子量 重均分子量 Z均分子量Z+1均分子量Hi： 峰高 Mi：分子量,,,Mz+1 =,ΣMi 3Hi,S Mi 2Hi,,,9,平均分子量含義,數(shù)均分子量 (Mn)拉力、抗沖擊性重均分子量 (Mw)脆度

5、Z 均分子量 (Mz)彈性、硬度分布寬度指數(shù)D(分散度)= Mw/Mn對(duì)于多分散試樣 Mn ＜ Mw ＜ Mz,10,高聚物多分散性表征,樣品間分子量分布寬度的比較，最直接的方法是將實(shí)驗(yàn)所得到的分子量分布曲線作對(duì)比。分子量分布曲線有兩種形式：用重量分?jǐn)?shù)W對(duì)分子量作圖的曲線叫做微分分布曲線；用累積重量分布對(duì)分子量作圖的曲線叫做積分分布曲線。還有一種更一般化且最常用的方法就是重均數(shù)均比，即：Mw/Mn。,11,測(cè)定聚合物分

6、子量的方法,直接方法滲透壓方法 (for Mn)光散射方法 (for Mw)粘度方法 (for Mv)超速離心方法 (for Mz)間接方法GPC (for Mn, Mw and Mz)用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣得到分子量校正曲線，間接算出聚合物樣品的相對(duì)分子量。如和標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)不同，還需進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算才能得到聚合物樣品自身的分子質(zhì)量。,12,為什么要用GPC方法,相對(duì)分子量分布(多分散性指數(shù))對(duì)聚合物的性質(zhì)有重要影響。在相對(duì)分子質(zhì)

7、量分布（多分散性指數(shù)）成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)后，經(jīng)典方法卻不能同時(shí)測(cè)定聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布。凝膠滲透色譜(GPC)的應(yīng)用改善了測(cè)試條件，并提供了可以同時(shí)測(cè)定聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的方法，使其成為測(cè)定高分子相對(duì)分子質(zhì)量及其分布最常用、快速和有效的技術(shù)。,13,GPC系統(tǒng)配置,需要GPC軟件才可計(jì)算MW,14,配置實(shí)例,15,GPC系統(tǒng)與常規(guī)HPLC系統(tǒng)區(qū)別,檢測(cè)器GPC系統(tǒng)標(biāo)配示差折光檢測(cè)器常規(guī)HPLC有多種檢測(cè)器可選梯度G

8、PC系統(tǒng)是等度系統(tǒng)，并且用并聯(lián)泵常規(guī)HPLC可以是等度或者梯度管路GPC系統(tǒng)采用全不銹鋼流路常規(guī)HPLC用PEEK或者不銹鋼流路自動(dòng)進(jìn)樣器針密封GPC系統(tǒng)采用Vespel?針密封，適用THF、氯仿、DMF等常規(guī)HPLC用PEEK針密封,16,LCsolution GPC軟件,,該 GPC 可選軟件可在 LCsolution 上無縫地運(yùn)行。作為 LCsolution 的一部分，此軟件擴(kuò)展了方法、數(shù)據(jù)和報(bào)告格式文件的功能，并可

9、使用 LCsolution 的所有功能特性。,特點(diǎn)：1) 可以操作 GPC 與 LC 工作站2) 對(duì)方法和數(shù)據(jù)文件的統(tǒng)一管理3) 兼容多個(gè)系統(tǒng)和多個(gè)檢測(cè)器（包括 PDA 檢測(cè)器）4) 同時(shí)輸出色譜圖報(bào)告和 GPC 計(jì)算結(jié)果5) 可以根據(jù)控制樣品進(jìn)行保留時(shí)間的校準(zhǔn),,17,GPC色譜柱系列,Shim-pack GPC-80X for THFShim-pack GPC-80XC for 氯仿Shim-pack GPC-8

10、0XD for DMF排阻極限 (聚苯乙烯)1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802), 2x104(GPC-8025), 7x104(GPC-803), 4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M), 2x108(GPC-807),18,GPC色譜柱類型,普通凝膠柱按照不同的排阻極限分成很多種型號(hào)(如GP

11、C-80X)每種排阻極限的柱子使用同一種凝膠顆粒在一段范圍內(nèi)校正曲線成線性混合凝膠柱一種型號(hào)(如GPC-80M)使用混合凝膠顆粒在較寬范圍內(nèi)校正曲線都成線性，可消除不同柱子串聯(lián)時(shí)可能產(chǎn)生非線性校正曲線導(dǎo)致結(jié)果偏差的問題,19,GPC色譜柱類型,混合凝膠柱GPC-80M,,20,GPC色譜柱選擇,按照樣品所溶解的溶劑來選擇柱子所屬系列THF、氯仿、DMF必須選擇合適的溶劑來溶解聚合物按照樣品分子量范圍來選擇柱子型號(hào)樣品

12、分子量應(yīng)該處在排阻極限和滲透極限范圍內(nèi)，并且最好是處在校正曲線線性范圍內(nèi),21,標(biāo)樣,聚苯乙烯(PS，溶于各種有機(jī)溶劑)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)聚環(huán)氧乙烷 (PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水)聚乙二醇(PEG，溶于水)(PEO與PEG的碳鏈骨架相同，但是其合成原料和封端不同，由于原料的性質(zhì)，使其產(chǎn)物的分子量和結(jié)構(gòu)都有一定的區(qū)別。PEO常是指一端為甲基封端，一端為羥基封端的聚環(huán)氧乙烷，而PEG一般是兩端都是羥基封端的聚乙二醇。

13、),22,校正曲線,逐一注入聚合物標(biāo)樣以確定分子量與保留時(shí)間的關(guān)系,常用線性擬合或者三次方擬合,23,GPC校正方法,窄分布標(biāo)樣校正法選用與被測(cè)樣品同類型的單分散性(d≤1.1)標(biāo)樣，先用其他方法精確測(cè)定其平均相對(duì)分子質(zhì)量，然后與被測(cè)樣品在同樣的條件下進(jìn)行GPC分析。 普適校正法此法的優(yōu)點(diǎn)是只要用一種高聚物（一般用窄分布聚苯乙烯）作標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以測(cè)定其他類型的聚合物，但先決條件是2種高聚物的K和α值必須己知。漸進(jìn)試差法(寬分布標(biāo)

14、樣校正法)這種方法不需要窄分布樣品，其標(biāo)樣可為1~3個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量的寬分布標(biāo)樣（平均相對(duì)分子質(zhì)量精確測(cè)量，Mw和Mn為已知），采用數(shù)學(xué)處理方法得到漸進(jìn)試差法的校正曲線。,24,窄分布標(biāo)樣校正法,要有5個(gè)以上的不同分子量的單分散標(biāo)樣來制作校正曲線樣品最好與標(biāo)樣是相同的結(jié)構(gòu)。如果樣品與標(biāo)樣結(jié)構(gòu)完全一樣，則結(jié)果不需再修正如果樣品結(jié)構(gòu)與標(biāo)樣結(jié)構(gòu)不一樣，并且樣品是單鏈結(jié)構(gòu)，則可以用QF因子比來修正結(jié)果如果樣品結(jié)構(gòu)與標(biāo)樣結(jié)構(gòu)不一樣，并

15、且樣品帶有支鏈，則無法使用窄分布標(biāo)樣校正法,25,窄分布標(biāo)樣校正法-分子量轉(zhuǎn)換,QF因子比(RQF)QF定義：?jiǎn)挝绘滈L(zhǎng)分子量?jī)H適用于單鏈聚合物,26,聚苯乙烯的QF,QF=104 / 2.50 = 41.5 -( CH-CH2 )n- C6H5 單位鏈長(zhǎng)的MW = 104一個(gè)單位長(zhǎng)度為 2.50 A.C-C 鍵

16、長(zhǎng)度約為 1.54 A.C-C-C 鍵角度約為 109度.一個(gè)單位長(zhǎng)度計(jì)算如下： 1.54 x sin(109 / 2) x 2 =2.50,,27,聚苯乙烯的QF,C,C,C,C,,,,,,,109,,,,1.54 A,,,,1.54 x sin (109/2),,1.54 x sin (109/2) x 2,2.50 A,C,,C,,28,聚異丁烯的QF,QF = 56 / 2.50 = 22.3

17、 CH3 -(C-CH2)n- CH3 單位鏈長(zhǎng)的MW = 56一個(gè)單位長(zhǎng)度為 2.50 A.,,,29,RQF,聚異丁烯與聚苯乙烯的QF之比為 RQF. RQF = 22.3 / 41.5 = 0.537 M 聚異丁烯= M GP

18、C x 0.537,30,RQF的制約因素,RQF 僅適用于單鏈聚合物如果聚合物有支鏈結(jié)構(gòu), MW的計(jì)算就有誤,,,,31,普適校正法,用一種高聚物標(biāo)樣做校正曲線，常用聚苯乙烯樣品結(jié)構(gòu)可以與標(biāo)樣不一樣，并且可以有支鏈樣品及標(biāo)樣在流動(dòng)相溶劑中的K和α值必須己知可以用粘度法來測(cè)定K和α的值,32,普適校正法公式,GPC反映的是淋洗體積與高聚物流體力學(xué)體積間的關(guān)系。根據(jù)Einstein粘度關(guān)系： [η]為特

19、性粘度；v′表示聚合物鏈等效的流體力學(xué)體積；N為阿佛加德羅常數(shù)；M為聚合物分子量。根據(jù)上式可用[η]M表示流體力學(xué)體積。,33,普適校正法公式,當(dāng)樣品與標(biāo)樣有相同的淋洗體積時(shí)，下式成立：  式中下標(biāo)1為標(biāo)樣參數(shù)，2為樣品參數(shù)。將Mark-Houwink方程([η]=KMα)代入，即得到：從而得出：,,,34,漸進(jìn)試差法(寬分布標(biāo)樣校正法),不需要窄分布標(biāo)樣，只需要寬分布標(biāo)樣標(biāo)樣和樣品為

20、同一種物質(zhì)標(biāo)樣數(shù)量最少可以只有1個(gè)標(biāo)樣的分子量Mw和Mn必須已知標(biāo)樣校正曲線呈線性,35,漸進(jìn)試差法(寬分布標(biāo)樣校正法),在一定條件下，有：(1)將標(biāo)樣色譜峰分成若干個(gè)切片，則：(2)根據(jù)定義，有： (3) (4)將公式(2)代入公式(3)和(4)，則：(5) (6)標(biāo)樣的M

21、w和Mn已知，將Hi,Vi代入，軟件自動(dòng)算出A,B值。,,,,36,GPC分析大致步驟,根據(jù)樣品的特點(diǎn)選擇合適的GPC柱子和標(biāo)樣，并且確定采用的GPC校正方法配制標(biāo)樣和樣品，用LCsolution進(jìn)樣得到色譜圖用LCsolution GPC生成校正曲線并計(jì)算樣品平均分子量，制作報(bào)告,37,GPC系統(tǒng)安裝注意事項(xiàng),安裝色譜柱柱子串聯(lián)時(shí)排阻極限大的接前面管路選擇使用全不銹鋼流路，不能有PEEK材質(zhì)的部件存在溶劑更換水和氯仿不互

22、溶最高壓力設(shè)置柱子串聯(lián)時(shí)將最高壓力設(shè)為所有柱子允許承受的最高壓力之和柱子使用注意事項(xiàng)一定要嚴(yán)格按照說明書使用色譜柱(部分柱子不能用甲醇沖洗)氯仿柱子要用氯仿沖洗柱子，THF柱子要用THF沖洗，氺相柱子一般用60水40乙腈保存,38,安裝色譜柱,通常而言，分析結(jié)果與色譜柱組安裝的順序無關(guān)。盡管如此，為了提高分離度和延長(zhǎng)色譜柱壽命，應(yīng)按孔徑由大到小順序安裝色譜柱，即排阻極限大的接前面，排阻極限小的接后面。原因在于，孔徑越大，越粗糙

23、，越能承受外來物質(zhì)的積累污染。而且，樣品中高分子量的物質(zhì)對(duì)樣品的粘度影響最大。如果大分子先被分離，粘度下降更快，對(duì)色譜柱的壓力降低。,39,GPC分析注意事項(xiàng),如何配制標(biāo)樣和樣品系統(tǒng)平衡柱子沖洗及保存校正曲線有效時(shí)間親水性聚合物分析,40,GPC標(biāo)樣配制,由于凝膠色譜中濃度檢測(cè)通常使用示差折光檢測(cè)器，其靈敏度不太高，所以試樣的濃度不能配置得太稀。但另一方面色譜柱的負(fù)荷量是有限的，濃度太大易發(fā)生“超載”現(xiàn)象。一般情況下，進(jìn)樣濃度

24、按分子質(zhì)量大小的不同在0.05~0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）范圍內(nèi)配置。分子質(zhì)量越大，溶液濃度越低。標(biāo)樣配制應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)樣說明書進(jìn)行。通常室溫靜置12小時(shí)以上，然后輕輕混勻。絕對(duì)不能超聲或者劇烈振蕩來加速溶解。溶液進(jìn)樣前應(yīng)先經(jīng)過過濾，以防止固體顆粒進(jìn)入色譜柱內(nèi)，引起柱內(nèi)堵塞，損壞色譜柱。,41,GPC標(biāo)樣配制,一種分子量的標(biāo)樣進(jìn)樣一次得到標(biāo)樣色譜圖，這樣的結(jié)果是最理想的。通常，為節(jié)約時(shí)間，可以將分子量相差較大(峰不會(huì)重合)的兩種標(biāo)樣配制在

25、一個(gè)瓶中，然后進(jìn)樣，可以節(jié)約一半的標(biāo)樣分析時(shí)間。如8個(gè)不同分子量的標(biāo)樣可以按右表編成4組分別進(jìn)樣。,42,進(jìn)樣濃度范圍及體積,分子量范圍 樣品濃度低于5,000 <1.0%5,000～25,000 <0.5%25,000～200,000 <0.25%200,000～2,000,000 <0.1%高于2,000,000 <0.05%進(jìn)樣體積50-100uL之間(濃度在0.05%-0.

26、5%之間),43,GPC系統(tǒng)平衡,安裝色譜柱之前，用兩通管連接管路，用流動(dòng)相替換系統(tǒng)后換上GPC柱子。(注意溶劑互溶情況)RID平衡操作分析開始前，用流動(dòng)相沖洗檢測(cè)器流路。流動(dòng)相流速1ml/min，切換到R Flow，使流動(dòng)相通過檢測(cè)池的樣品池和參比池，沖洗20min左右。然后切換R Flow 流路數(shù)次，將氣泡趕出檢測(cè)池。關(guān)閉R Flow，等待基線平穩(wěn)。當(dāng)Balance 值高于50，進(jìn)行Balance 調(diào)整。色譜柱平衡等

27、溶劑峰出峰后在經(jīng)過約一次分析時(shí)間后基線才能走平。,44,GPC柱子沖洗及保存,如果在24h內(nèi)再次使用色譜柱，無需特別的處理步驟。如果長(zhǎng)時(shí)間不使用，應(yīng)用保存溶劑沖洗色譜柱，拆下色譜柱，上緊堵頭，放入色譜柱盒子中保存。嚴(yán)格按照柱子說明書中允許條件下使用。避免振動(dòng)和機(jī)械撞擊。專柱專用，經(jīng)常改變樣品和溶劑會(huì)加速色譜柱惡化，降低分離度。,45,GPC校準(zhǔn)曲線有效時(shí)間,每周用標(biāo)樣評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果偏差大于0.10M（10%），重做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

28、更換色譜柱后，需重做標(biāo)準(zhǔn)曲線。,46,親水性聚合物分析注意事項(xiàng),使用親水性 GPC 柱Shodex OHpak SB-800 HQ seriesTOSOH TSK-GEL PW series 使用葡聚糖，聚乙二醇和聚氧化乙烯作為標(biāo)準(zhǔn)物使用鹽如(50mmol/L) NaCl, NaNO3, LiCl 等以消除離子間引力使用有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等以消除疏水性作用力,47,GPC分析例,色譜柱：Shodex GPC KF-804,

29、802,801三根串聯(lián)保護(hù)柱：Shodex GPC KF-G流動(dòng)相：THF流 速：1.0ml/min柱 溫：50℃進(jìn)樣量：50ul檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器RID-10A標(biāo)準(zhǔn)品：PS(聚苯乙烯）(8個(gè)不同分子量標(biāo)樣),48,標(biāo)準(zhǔn)品及樣品配制方法,分子量校準(zhǔn)曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品為PS，有8種不同分子量的標(biāo)品。將它們按下表分為4組，每組含2種標(biāo)品，各稱約4mg左右，然后用20ml流動(dòng)相溶解，配成4個(gè)標(biāo)樣。稱量5m

30、g樣品，加入4ml流動(dòng)相溶解過夜。,49,標(biāo)樣圖譜,四種顏色分別表示四個(gè)標(biāo)樣的圖譜,50,分子量校準(zhǔn)曲線,51,樣品分析結(jié)果,52,PS1和PS2為同一操作人員測(cè)定同一樣品的兩次測(cè)定結(jié)果PS3為另一實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣品測(cè)得的結(jié)果,結(jié)果評(píng)價(jià)示例,53,重復(fù)性考察對(duì)于數(shù)均分子量同一操作人員兩次測(cè)定值之差，不應(yīng)超過式（1）的數(shù)值r m ：r m= 0.10Mn平均 （1）式中：Mn平均表示數(shù)均分子量的平均值。對(duì)于多分散系數(shù)同一操作者兩次測(cè)定

31、值之差，不應(yīng)超過式（2）的數(shù)值r D ：r D=0.06D （2）式中：D表示多分散系數(shù)測(cè)定值的平均值。r m=0.10×（72645+71965）/2=7231ΔMn（室內(nèi)）=Mn2-Mn1=72645-71965=680（0.0094）r D=0.06×(1.032+1.041)/2=0.062ΔD （室內(nèi)）=D 2-D 1=1.041-1.032=0.009（0.0086）對(duì)于樣品PS，同一操作者

32、兩次數(shù)均分子量測(cè)定值之差ΔM n小于r m；多分散系數(shù)之差ΔD 小于r D，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很好。,數(shù)均分子量和多分散系數(shù)重現(xiàn)性,54,對(duì)于數(shù)均分子量，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室各測(cè)一次的結(jié)果之差，不應(yīng)超過式（3）的數(shù)值R Mn ：R Mn=0.25 Mn平均 （3）式中：Mn平均表示數(shù)均分子量測(cè)定值的平均值。對(duì)于多分散系數(shù)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室提出的結(jié)果之差，不應(yīng)超過式（4）的R D ：R D=0.15D （4）式中：D表示多分散系數(shù)測(cè)定值的平均值。