定量檢驗(yàn)的分析性能驗(yàn)證

1、定量檢驗(yàn)的分析性能驗(yàn)證,浙江省立同德醫(yī)院王 偉,引言,依據(jù)衛(wèi)生部《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》第三十條款CNAS-CL02：2008《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（IOS15189:2007）第5.5條款實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對方法學(xué)進(jìn)行評價(jià)，以檢查其分析性能和對預(yù)期用途的適用性。,,CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（IOS15189:2012,IDT）第5.5條款檢驗(yàn)程序的性能特征宜包括：測量正確度、測量準(zhǔn)確度、測

2、量精密度(含測量重復(fù)性和測量中間精密度)、測量不確定度、分析特異性（含干擾物）、分析靈敏度、檢出限和定量限、測量區(qū)間、診斷特異性和診斷靈敏度,,,why,為什么要做性能驗(yàn)證？,性能驗(yàn)證是為了確保實(shí)驗(yàn)室開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目，所應(yīng)用的檢測系統(tǒng)的分析性能或檢驗(yàn)項(xiàng)目的方法學(xué)(檢驗(yàn)程序)能夠滿足檢測及臨床要求，從而保證患者標(biāo)本檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。,進(jìn)行性能驗(yàn)證的場所,按照實(shí)驗(yàn)室管理辦法和認(rèn)可準(zhǔn)則的要求，醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)承擔(dān)所開展檢驗(yàn)項(xiàng)目的性能驗(yàn)證工作

3、。,where,when,何時(shí)需要做性能驗(yàn)證？,以下情況應(yīng)完成初次性能驗(yàn)證：新安裝的儀器擬開展的項(xiàng)目；新開展項(xiàng)目；同一項(xiàng)目的試劑變更廠家或檢驗(yàn)方法發(fā)生變更時(shí)；儀器校準(zhǔn)、發(fā)生故障維修后或更換主要的配件后，可能對結(jié)果產(chǎn)生較大的影響時(shí)，可選擇其所開展的部分檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行分析性能驗(yàn)證。,when,,初次驗(yàn)證后，對精密度、正確度及可報(bào)告范圍等性能參數(shù)至少每12個(gè)月進(jìn)行一次評估，可通過評估如CV、均值等室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的變化趨勢（批間精密度）、室間質(zhì)評

4、項(xiàng)目的結(jié)果的可接受性（正確度）、臨床醫(yī)護(hù)人員對結(jié)果的反饋（可報(bào)告范圍）、小樣本的驗(yàn)證等多種方式進(jìn)行。若評估的結(jié)果不可接受，則需重新進(jìn)行性能驗(yàn)證。,哪些人員可以進(jìn)行性能驗(yàn)證試驗(yàn)?,性能驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室有資質(zhì)的檢驗(yàn)人員完成，必要時(shí)可由技術(shù)支持人員協(xié)助完成試驗(yàn)；而性能驗(yàn)證報(bào)告必須由資深的檢驗(yàn)人員完成，并經(jīng)科室主任審核后歸檔保存。,who,性能驗(yàn)證包括哪些方面,定量項(xiàng)目性能驗(yàn)證的內(nèi)容包括但不限于：精密度（批內(nèi)、批間）；正確度；檢測低限（靈敏度

5、）；攜帶污染率；線性范圍；可報(bào)告范圍；生物參考區(qū)間；檢驗(yàn)結(jié)果量值溯源；測量不確定度；等。,what,如何實(shí)施性能驗(yàn)證？,準(zhǔn)備工作 范圍、材料、方案：應(yīng)確定定量檢測的項(xiàng)目；所需的儀器、配套試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等材料；制定完整的性能驗(yàn)證方案（尤其是各項(xiàng)性能參數(shù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定及其依據(jù)）。,how,,試驗(yàn)要求：儀器應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)或保養(yǎng)；要盡可能在相同條件下進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)；所有試驗(yàn)均需在室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果在控的情況下方可進(jìn)行。,性能驗(yàn)證試驗(yàn),對于配套系

6、統(tǒng)，一般驗(yàn)證以下內(nèi)容 準(zhǔn)確度---EP-15 精密度---EP-5 可報(bào)告范圍---EP-6 參考區(qū)間---C28-A2對于非配套系統(tǒng)，內(nèi)容更多,一、精密度試驗(yàn),精密度試驗(yàn),在規(guī)定條件下，多次重復(fù)測定同一量時(shí)各測定值之間彼此相符合的程度 包括：重復(fù)性、再現(xiàn)性、中間精密度、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度,精密度試驗(yàn),在規(guī)定條件下，多次重復(fù)測定同一量時(shí)各測定值之間彼此相符合的程度 包括： 重復(fù)性(repeatability)

7、 中間精密度(intermediateprecision) 重現(xiàn)性(reproducibility) 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度（within-labprecision),,,,,中間精密度:簡單地說中間精密度是處于重復(fù)性條件與再現(xiàn)性條件之間的條件下得到的精密度。 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度：同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，使用同樣的設(shè)備，由不同操作者在不同時(shí)間內(nèi)獲得的精密度，以前曾被稱為總精密度（不包括大的設(shè)備維護(hù)、儀器校準(zhǔn)和更換試劑批號(hào)）,

8、,文件依據(jù) CLSI （原NCCLS）頒布的EP5-A2文件《定量測量方法的精密度性能評價(jià)-批準(zhǔn)指南第二版》,,用于評估試驗(yàn)的樣品 一般常采用臨床實(shí)驗(yàn)室收集的穩(wěn)定和冷凍貯存的血清(漿)庫;當(dāng)實(shí)驗(yàn)室收集的樣品不穩(wěn)定或不易得到時(shí)，也可考慮使用穩(wěn)定的、以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的商品，如廠家的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。一般采用日常工作中的室內(nèi)質(zhì)控品。,,樣品濃度 評估精密度時(shí)，建議評估高低二個(gè)濃度的精密度。當(dāng)二個(gè)濃度的精密度有顯著差異時(shí)，建議增加

9、為三個(gè) 濃度。 所選濃度應(yīng)為在測量范圍內(nèi)有醫(yī)學(xué)意義的值，即至少有一 個(gè)濃度在醫(yī)學(xué)決定水平(medical decision levels)左右。不要為了得到較小的精密度，都選用較高值的樣品，甚至超出 測量范圍。也不應(yīng)選用靠近最低檢出限的樣品，此時(shí)所得 的精密度往往偏大。 如沒有醫(yī)學(xué)決定水平，可在參考區(qū)間上限左右選一個(gè)濃度 。此外再

10、根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目的性質(zhì)在線性區(qū)間內(nèi)選擇一個(gè)值。,,試劑和校準(zhǔn)品 評估批內(nèi)精密度時(shí)，要求在整個(gè)評估階段，盡可能使用相同條件，應(yīng)使用同一種類同一批號(hào)的試劑和校準(zhǔn)物,如有可能,只進(jìn)行一次校準(zhǔn)。使用不同批號(hào)試劑和多次校準(zhǔn)都會(huì)增加檢驗(yàn)結(jié)果的變異程度。,測量重復(fù)性（批內(nèi)精密度）,試驗(yàn)方法：連續(xù)重復(fù)測定20/21次；結(jié)果計(jì)算：計(jì)算后20次檢測結(jié)果的SD和CV；判斷標(biāo)準(zhǔn)：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評評價(jià)界限作為允許總誤差（TEa），批內(nèi)精密度<1/4

11、TEa；或者符合試劑說明書的要求。注意事項(xiàng)：若選擇標(biāo)本，則其濃度應(yīng)盡可能接近質(zhì)控品或試劑說明書中評價(jià)該性能所提供的標(biāo)本濃度,測量再現(xiàn)性（批間精密度）,試驗(yàn)方法：每天1次測試，連續(xù)測試20天；或每天2次測試，連續(xù)測試10天；或每天4次測試，連續(xù)測定5天; 結(jié)果計(jì)算：剔除離群值后，計(jì)算20次檢測結(jié)果的SD和CV；判斷標(biāo)準(zhǔn)：<1/3TEa；或者符合試劑說明書的要求。注意事項(xiàng)：若選擇標(biāo)本，首先應(yīng)考慮檢測物的穩(wěn)定性，濃度要求同批內(nèi)

12、精密度；若檢測物不穩(wěn)定，則必須使用質(zhì)控品進(jìn)行該試驗(yàn)。,,總誤差（TEa）從CLIA’ 88允許誤差表中查閱評價(jià)的該項(xiàng)目的允許誤差范圍。 沒有CLIA 88允許誤差范圍的項(xiàng)目: EQA的允許誤差 試劑說明書提供,二、正確度與準(zhǔn)確度,,?準(zhǔn)確度(accuracy): 一次測量的結(jié)果與被測量真值的接近程度。 ?正確度(trueness): 真實(shí)度，大量測量的均值與真值的接近程度。,,,,文件依據(jù) CLSI 頒布的E

13、P15-A文件《用戶對精密度和準(zhǔn)確度性能的核實(shí)指南》,,實(shí)驗(yàn)方法 測定具有溯源性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)物質(zhì) 參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評 樣本室間比對：要求與使用相同檢測方法的、質(zhì)量保證措施較好的、或已獲認(rèn)可或的實(shí)驗(yàn)室，或與使用配套分析系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對,,對3個(gè)不同水平的質(zhì)控品每個(gè)測定2次，測定均值與靶值的偏差小于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評的允許誤差表示準(zhǔn)確度可以接受,三、可報(bào)告范圍驗(yàn)證,,,? 線性范圍（Li

14、near Range)是指系統(tǒng)最終的輸出值（濃度或活性）與被分析物的濃度成正比的范圍。 ? 分析測量范圍（Analytical Measurement Range）方法直接測量標(biāo)本，而不需要任何的稀釋、濃縮或者其它預(yù)處理等過程下，測量結(jié)果總誤差符合要求的分析物濃度的范圍。 ? 臨床可報(bào)告范圍（Clinically Reportable Range)是方法可采用對標(biāo)本的稀釋、濃縮或者其他預(yù)處理用于擴(kuò)展直接分析測量下的分析物值的范圍。,

15、,可報(bào)告范圍（Reportable Range）：實(shí)驗(yàn)室可建立或驗(yàn)證儀器或檢測系統(tǒng)測量相應(yīng)的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果值的范圍。,,? 文件依據(jù) CLSI 頒布的EP6-A文件《定量測量方法的線性評價(jià)》,,? 儀器 應(yīng)有較好的測定精密度及不存在明顯的攜帶污染等。對儀器應(yīng)進(jìn)行定期維護(hù)及校準(zhǔn)，保證其處于 正常狀態(tài)。 ? 試劑 應(yīng)注意試劑有效期及批號(hào)，不可采用過期試劑或 不同批號(hào)的試劑。 ? 校準(zhǔn)品 可采

16、用與評價(jià)試劑配套的校準(zhǔn)品。校準(zhǔn)品的使用應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明，儀器校準(zhǔn)步驟與間隔應(yīng)按 照本室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。,,? 樣品類型 為避免基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響，選用的樣品應(yīng)與臨床實(shí)驗(yàn)樣品相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣品，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣品。樣品物濃度應(yīng)包括試劑廠商提供的試劑所能達(dá)到的線性范圍。,,? 樣品制備 收集臨床檢測過程中的高值樣品（H）和低值樣品(L)，若收集

17、不到低值樣品，可用生理鹽水或蒸餾水替代。將H和L樣品按：1L、3L+1H、2L+2H、 1L+3H、1H關(guān)系各自配制(必要時(shí)可改變比例)混合，形成系列評價(jià)樣品。,,? 樣品測定 在進(jìn)行線性范圍確立時(shí)，應(yīng)進(jìn)行7-11個(gè)濃度水平的樣品測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定2-4次。進(jìn)行可報(bào)告范圍驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)進(jìn)行5個(gè)濃度水平的樣品測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定2次。如果測定方法本身存在明顯的攜帶污染，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采取恰當(dāng)措施盡量避免對測定結(jié)果的影響

18、。,,? 結(jié)果分析 1、以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，以實(shí)測值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到直線回歸方程Y＝aX+ b ， a在0.97～1.03范圍內(nèi)，r2＞0.95 ； 2、偏倚在允許誤差范圍之內(nèi)。,,可報(bào)告范圍的高限=可接受最大稀釋倍數(shù)×線性范圍（AMR）上限值；可報(bào)告范圍的低限：線性范圍的檢測低限或功能靈敏度為可報(bào)告范圍的低限。,四、參考區(qū)間的驗(yàn)證,,,驗(yàn)證已知參考區(qū)間在本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可接受性。,,?

19、 實(shí)驗(yàn)方法 1、從健康人群中抽出20個(gè)參考個(gè)體（最好能夠覆蓋各個(gè)年齡段），依照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢測樣本。 2、發(fā)現(xiàn)離群值應(yīng)棄用，并新的參考個(gè)體代替，以確保測試結(jié)果不含離群值。,,3、如果20例參考個(gè)體中不超過2例（10％的結(jié)果）的檢測值在參考區(qū)間外，則已知的參考區(qū)間可以接受。若3例以上超出界限，再選擇20個(gè)參考個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，若少于或等于2個(gè)檢測值超過已知參考限，則已知參考區(qū)間可以接受。若又有3個(gè)以上超出參考限

20、，則就應(yīng)該重新檢查所用的分析程序，考慮兩個(gè)樣本總體生物學(xué)特征上可能存在差異，并且考慮是否按照大規(guī)模研究指南建立自己的參考區(qū)間。,,關(guān)鍵在于——篩選“健康人群” 參考個(gè)體不應(yīng)該是住院患者或者臨床病人，除非絕對需要。諸如可能是必需的小兒科或老年人的研究。,需要排除,經(jīng)常喝酒近期患病 獻(xiàn)血者哺乳期 血壓不正常肥胖 吸毒特殊職業(yè) 正在服用醫(yī)生開方的藥物濫用維生素,口服避孕劑 正在服用自購藥物懷孕 某些環(huán)境因素近期手

21、術(shù) 禁食或者非禁食吸煙 遺傳易感因素近期接受輸血 正在住院治療或最近住過院,,? 結(jié)果分析 按照實(shí)驗(yàn)方法評估參考區(qū)間的可接受性。,五、攜帶污染的檢測,,,為了監(jiān)測生化分析儀的技術(shù)性能，評價(jià)其攜帶污染率是否能達(dá)到有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。攜帶污染率：指不同濃度樣品間連續(xù)測定的相互影響，主要是高濃度樣品對低濃度樣品的污染。,,實(shí)驗(yàn)方法 選擇高值和低值兩份血清，按3次高值-3次低值順序測定，記錄測定結(jié)果，計(jì)算出均值和攜帶污染

22、率。,,計(jì)算公式 攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)*100% 其中H3代表第三次高值，L1代表第一次低值，L3代表第三次低值,,結(jié)論：平均攜帶污染率根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)要求一般生化分析儀在2%范圍內(nèi)屬于可接受.,六、測量不確定度評定,,第一步 規(guī)定被測量,說明正在測量什么，包含：系統(tǒng)（需要對存在時(shí)間和空間的說明），如血清；組分及分析物，如鈣離子；量、質(zhì)量、濃度、活性等，如mmol/L,測量不確定度,CNAS-CL02：《

23、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（IOS15189:2012,IDT）第5.5.1.4條款實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為檢驗(yàn)過程中用于報(bào)告患者樣品被測量值的每個(gè)測量程序確定不確定度，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定每個(gè)測量程序的測量不確定度性能要求，并定期評審測量不確定度的評估結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室在屆時(shí)結(jié)果量值時(shí)應(yīng)考慮測量不確定度。需要時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)向用戶提供測量不確定度評定結(jié)果,測量不確定度評定方法,不確定度的評定方法有自上而下（Botton-up）和自上而下（Top-down）醫(yī)

24、學(xué)實(shí)驗(yàn)室適用自上而下（基于正確度和精密度兩個(gè)主要分量）,不確定度評定過程,第一步 規(guī)定被測量第二步 識(shí)別不確定度來源第三步 量化不確定度第四步 計(jì)算合成不確定度,第二步 識(shí)別不確定度來源,①樣品（取樣程序、樣品代表性、存儲(chǔ)條件）②精密度（重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性）③校準(zhǔn)（溯源性、值得不確定度、校準(zhǔn)方法）④校準(zhǔn)值正確性和測量不確定度、校準(zhǔn)品與參考物質(zhì)的互通性⑤與樣本相關(guān)的效應(yīng)（基質(zhì)、干擾物）⑥試劑、校準(zhǔn)品和參考物質(zhì)

25、的批間差⑦不同的操作者⑧器材的變異（天平、移液器、容量瓶等）⑨環(huán)境的變化（溫度、濕度、震動(dòng)、電壓等）,第三步 量化不確定度,1.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測量復(fù)現(xiàn)性引入的測量不確定度評定（推薦的優(yōu)先次序）：①從實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)計(jì)算②從實(shí)驗(yàn)室間比對（PT）數(shù)據(jù)計(jì)算③從重復(fù)測量常規(guī)樣本的合并標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算,第三步 量化不確定度,2.偏倚引入的測量不確定度的評定（推薦的優(yōu)先次序）①使用有證參考物質(zhì)（CRM），包括正確度質(zhì)控品②應(yīng)用PT數(shù)據(jù)（

26、無計(jì)量溯源性PT項(xiàng)目應(yīng)慎用）③與參考測量方法比較,第四步 計(jì)算合成不確定度,1.合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度： 合成前，所有不確定度分量都必須以標(biāo)準(zhǔn)不確定度即標(biāo)準(zhǔn)偏差表示合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算 UC=√u2c(bias)+u2(Rw)+…. uc(bias)為標(biāo)準(zhǔn)偏倚不確定度 u(Rw)為室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性不確定度,,第四步 計(jì)算合成不確定度,2.合成相對不確定度： 合成前，所有不確定度分量都必須以相對標(biāo)準(zhǔn)

27、不確定度表示合成相對不確定度計(jì)算 Ucrel=√u2crel(bias)+u2rel(Rw)+…. uc(bias)為相對偏倚不確定度 u(Rw)為相對室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性不確定度,,第四步 計(jì)算合成不確定度,3.擴(kuò)展不確定度 擴(kuò)展不確定度需要給出一個(gè)區(qū)間，合理地賦予被測量值的數(shù)量分布大部分會(huì)落在此區(qū)間內(nèi) 擴(kuò)展不確定度計(jì)算 U=K *uc Urel=K*ucr

28、el U為擴(kuò)展不確定度，Urel為相對擴(kuò)展不確定度 K為擴(kuò)展因子。正態(tài)分布K=2時(shí)，包含概率P=95.43%, K=3時(shí),包含概率P=99.73% 通常采用K=2,測量不確定度的報(bào)告,1.血清葡萄糖 GLU=5.13mmol/L,U=0.18mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率2. .血清葡萄糖 GLU=（5.13±0.18）mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率,測

29、量不確定度的報(bào)告,報(bào)告的有效數(shù)字，在應(yīng)用uc和U時(shí)大都采用兩位有效數(shù)字。在最終報(bào)告結(jié)果時(shí)一般做法是降測量不確定度修約到小數(shù)后一位（特殊要求例外）,小結(jié),方法學(xué)的分析性能驗(yàn)證包涵許多的內(nèi)容、技術(shù)要求較高，在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行分析，在質(zhì)量體系允許的范圍內(nèi)，選擇合適的試驗(yàn)方法完成此項(xiàng)工作，保留原始數(shù)據(jù)，結(jié)合制定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，綜合分析試驗(yàn)結(jié)果，以評價(jià)所選的檢驗(yàn)程序能否滿足臨床實(shí)驗(yàn)的要求，從而保障檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。,Thanks for