瓊脂稀釋法操作步驟

1、瓊脂稀釋法操作步驟,,原理：,將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成：128ｕg/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕg/ml對倍稀釋的濃度系列多點接種器將制備好的細菌菌懸液迅速點種到瓊脂表面,經(jīng)35℃16-20小時培養(yǎng)肉眼觀察細菌生長,以未見細菌生長平板的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC),抗菌藥物保存液的準備1,估算抗菌藥物最小稱量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128ｕg/ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1:14,即藥物濃度

2、將成15倍稀釋，因此保存液為 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml如果1次用量為10ml ,則: 抗菌藥物最小稱量=,,抗菌藥物保存液的準備2,抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進行藥物稀釋,稀釋液需要量見下列公式：稀釋液體積=,抗菌藥物保存液的準備3,實際操作：先計算完成一批試驗需幾次完成,每次用量多少,然后可一起稱量,一起稀釋,然后按每次需要量分裝在試管中,貼上標簽,注明藥物名稱,濃度

3、,體積數(shù)及配制日期,置與≤-20℃保存,備用。,,培養(yǎng)基,菌液準備1,生長法：無菌環(huán)取4-5個菌落大小形態(tài)一致的菌落頂部后接種于4-5mlMH肉湯內(nèi)35℃ 培養(yǎng)4-6小時到對數(shù)生長期，亦可過夜培養(yǎng),但不允許超過18小時用肉湯/生理鹽水校正至0.5麥氏管濃度1-2X108CFU/ml,菌液準備2,直接菌落懸浮法：從孵育了18-24h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用無菌環(huán)取單個菌落接種于無菌肉湯/生理鹽水內(nèi)校正至0.5麥氏管濃度1-2X1

4、08CFU/ml推薦用于苛氧菌和潛在的MRS,菌液準備3,對絕大多數(shù)細菌來說,上述用生長法或直接菌落懸浮法制備的0.5麥氏濁度的菌懸液,應該再用無菌肉湯或生理鹽水行1:10稀釋,此時菌液濃度為1-2*107CFU/ml,調(diào)整好的菌液應該在制備后的15分鐘內(nèi)完成點種,菌液準備4,如一次實驗需完成50株或100株細菌,則細菌要編上工作序號1-50或1-100,并在結(jié)果記錄紙上要一一對應寫上工作序號和菌種編號,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備 1,

5、配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌、厭氧菌等特殊細菌的培養(yǎng)基,待冷卻到48-50℃，澆制藥物平板。取滅菌的90mm平板12只,用記號筆在平板底部作好“點種標記”、“藥物名稱”、“藥物濃度”,濃度從0.06ｕg/ml……128ｕg/ml,每種濃度1只平板共12個濃度系列。,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2,取11支無菌玻璃試管(13Χ100mm),每支試管標記為：960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.875,

6、0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用無菌移液管加無菌稀釋液1.5ml,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3,將保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml濃度的抗菌藥物保存液取出融化后,用無菌移液管吸取2.5ml加入到128ｕg/ml標記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml加入到960標記的試管內(nèi),混勻后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml標記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml標記的玻璃試管內(nèi);混勻后再吸取2.

7、5ml依次類推,直至最后一個0.06ｕg/ml標記的平皿內(nèi)加入1ml,則抗菌藥物稀釋完成,瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4,準備2只無藥的平板,作點種前和點種后質(zhì)控對照所有藥物平板應保持表面干燥,不可有肉眼可見的水珠(可在35℃孵箱內(nèi)倒置平板開蓋烘干15-20分鐘),瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5,如果需使用的藥物平板為100Χ100mm的方平板,則 每根玻璃管內(nèi)需加入2.5ml的抗菌藥物稀釋液； 每次無菌吸管吸取的抗菌藥物量應該為4.5

8、ml 每只方平板應加入2ml抗菌藥物試液 無菌吸管內(nèi)應存留下2.5ml與下一個濃度的玻璃試管內(nèi)的2.5ml稀釋液進行充分混勻 藥敏培養(yǎng)基應加入28ml,測試菌液的點種1,預先將點種針和點種板高壓滅菌,并在孵箱內(nèi)烘干（52孔、100孔、或21孔）將已調(diào)整好濁度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量加樣器將菌液依次加入菌液點種板小孔內(nèi),并作好與藥物平板相應的點種標記,一般每小孔內(nèi)應加入菌液270ｕl。每批試驗均須保留有質(zhì)控菌位置

9、和無菌菌液位置用酒精棉球清潔多點接種器后，將點種針安裝在多點接種器架子上，再將加好菌液的點種板安置上多點接種器的點種板位置上,測試菌液的點種2,開啟多點接種器進行點種，因每一根點種針直徑約3mm,因此點種到藥物平板上每點的菌液量約為2ｕl，所以接種量為104 CFU/點點種時應先點種對照前的質(zhì)控平板，然后從最低藥物濃度開始點種依次點種到藥物濃度最高的平板,藥物平板的孵育,上述接種好的平板應在室溫下靜置至接種點上的菌液被瓊脂完全吸收，

10、再將藥敏平皿倒置，于35℃孵育16-20小時如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，則需33-35℃，絕對不能超過35℃，孵育24小時，閱讀結(jié)果萬古霉素藥敏試驗的腸球菌和葡萄球菌等需孵24小時后，閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空氣環(huán)境中孵育20-24小時，閱讀結(jié)果,結(jié)果閱讀和判斷,結(jié)果閱讀時，平板應置于黑色不反光的表面上，記錄的MIC是完全抑制細菌生長的最低抗生素濃度，單個菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽略不計。如果在MIC判斷