冷凍切片技術(shù)

1、第二章 生物組織冷凍切片技術(shù),冷凍切片技術(shù),冷凍切片（frozen section）是一種在低溫條件下，將動(dòng)物、植物組織快速冷卻到一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。因其制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，而應(yīng)用廣泛。冷凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冷凍切片法，二氧化碳冷凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冷凍切片法等。,2.1 CM 1900簡(jiǎn)介,CM 1900是徠卡奉獻(xiàn)給廣大用戶用于各種已知低溫冷凍切片的真正有效的儀器。 冷凍切片機(jī)用來(lái)

2、將生物組織的標(biāo)本快速冷凍后，將標(biāo)本在低溫狀態(tài)下進(jìn)行微米級(jí)的超薄切片，為生物組織的分析研究提供快速優(yōu)良的組織切片。特點(diǎn)：·新型CM 1900的特色之一是具有大型冷凍室，可冷卻到-35°C。·該儀器還提供一個(gè)獨(dú)立的樣品冷卻系統(tǒng)，樣品夾溫度的調(diào)節(jié)范圍達(dá)到-10°C到-50°C，可進(jìn)行不同類型的樣品切片，每一樣品托有各自獨(dú)立的溫度，并可在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到所需溫度,快速冷凍臺(tái)保持在-

3、45°C，可同時(shí)放多達(dá)10個(gè)樣品，并和一個(gè)可持續(xù)冷卻的吸熱器相連，可保證樣品托上的樣品快速冷卻.高質(zhì)量，無(wú)焊接縫的不銹鋼冷凍室表面光滑，利于清潔和防止污染。,規(guī)格參數(shù)：1.        切片厚度：1至60um2.        最大樣品：55 mm直徑3. &#

4、160;      樣品臂前后移動(dòng)：25 mm4.        樣品臂上下移動(dòng)：59 mm5.    樣品臂前后移動(dòng)速度：0.8mm/秒 冷凍箱溫度:0至-35℃6.      

5、60; 冷凍箱降溫至:-35℃約4小時(shí)7.        除霜功能:以熱氣9分鐘除霜,可自由于24小時(shí)內(nèi)設(shè)置開始時(shí)間8. 可隨時(shí)按制即時(shí)除霜. 快速冷凍臺(tái):至-45℃9.        機(jī)身大小(長(zhǎng)/深/高):890/730/1200mm10.   

6、 機(jī)身重量(連機(jī)切片):180kg11.     獨(dú)特雙壓縮作樣品快速冷凍及穩(wěn)定冷凍切片溫度12.     樣品快速冷凍:-10℃至-50℃,2.2 操作,,2.3 維護(hù),2.4 故障排除,2.5. 冷凍切片的一點(diǎn)體會(huì),取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為正方或長(zhǎng)方體：1×1×0.5cm ；

7、0.5 ×0.5×0.5cm 。 取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。,調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防

8、卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過(guò)刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15～

9、20℃左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30℃。,2.6 冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)：,防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過(guò)和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會(huì)破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí)，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺(tái)上凍起來(lái)，然后依據(jù)不同

10、的編號(hào)，依序切片，這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂。,放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢(shì)來(lái)放置，所謂“砍柴看柴勢(shì)”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。 組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭(zhēng)取時(shí)間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組

11、織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。,當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái)，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來(lái)軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一

12、起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片，由于溫度相同，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)象。,2.7 HE染色介紹,蘇木精 — 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，簡(jiǎn)稱HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性 ，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料 ，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。HE

13、染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。,染色結(jié)果 細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。 著色情況與組織或細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，很多細(xì)胞在新生時(shí)期胞漿對(duì)伊紅著色較淡或輕度嗜

14、堿，當(dāng)其衰老時(shí)或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時(shí)，伊紅著色由淺變深。,2.7.1 試劑配置,0.5~1% 的伊紅酒精溶液： 稱取伊紅Y 0.5~1 g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過(guò)濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無(wú)水乙醇配制也可）100毫升溶解。,蘇木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列減少),蘇木精 6 g 　　無(wú)水乙醇 100

15、ml 　　硫酸鋁鉀 150 g 　　蒸餾水 2000 ml 　　碘酸鈉 1.2 g 　　冰醋酸 120 ml 　　甘油 900 ml 　配制方法：將蘇木素溶于無(wú)水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸鈉。,1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。促藍(lán)液：1% 濃氨水溶液（1：99）,2.7.2 改進(jìn)的冷凍切片HE染色步驟,固定　切好的切片用95 %乙醇95 m