病理切片技術(shù)

1、病理切片技術(shù),,寧波明州醫(yī)院病理科主講人：周曉龍2016年2月17號(hào),石蠟切片,以石蠟制作的切片，可以制成極薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米，而石蠟切片不但可以達(dá)到這個(gè)要求，甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。另外，石蠟切片還便于制作大批的或是連續(xù)的切片，而且以石蠟包埋的組織塊便于長(zhǎng)期保存，所以石蠟切片是目前各種切片制作方法中最普遍常用的一種方法。,切片機(jī),切片機(jī)的基本類型有五種，按其結(jié)構(gòu)叫做： （1）搖動(dòng)式切片機(jī)，（2）

2、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，（3）滑動(dòng)式切片機(jī)，（4）推動(dòng)式（雪橇式）切片機(jī)，（5）冰凍切片機(jī)。最常用的是輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)。,切片機(jī),,切片機(jī),輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：系借轉(zhuǎn)動(dòng)手搖輪進(jìn)行切片動(dòng)作。是靠旋轉(zhuǎn)一個(gè)重輪，帶動(dòng)螺紋軸或齒輪，將組織塊夾具向前推進(jìn)，并在上下平面擺動(dòng)；推動(dòng)的距離靠一個(gè)有刻度的調(diào)節(jié)器控制，每一梯度為1或2微米。,切片前的準(zhǔn)備,恒溫水浴鍋首先預(yù)熱至35℃—40℃。蠟塊整修，將蠟塊組織面的石蠟用刀修去，使組織全部暴露出切面并修平，以減少切片刀的

3、磨損。 將鋒利的刀片裝入切片刀夾鉗內(nèi)，調(diào)整角度和位置后隨即緊固，檢查切片刀的傾斜度是否正確，傾角過(guò)大、則切片上卷；傾角過(guò)小則切片皺起，以20°-30°為佳。準(zhǔn)備好載玻片、小型毛筆、小型無(wú)鉤鑷子、鉛筆。,切片的步驟,將蠟塊固定于切片機(jī)頭上的夾座內(nèi)，調(diào)整到稍離開切片能夠切到的位置上，注意蠟塊組織切面與切片刀口要垂直平行。再調(diào)整蠟塊組織切面恰好與刀口接觸，旋緊刀架，固定好機(jī)頭。根據(jù)需要調(diào)整切片厚度。搖動(dòng)切片

4、機(jī)手輪先進(jìn)行修整切片，直到切出完整的最大組織切面后，再進(jìn)行切制。,切片的步驟,實(shí)踐中可用右手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)手輪，左手用毛筆托起蠟片，協(xié)調(diào)地進(jìn)行切片操作。切下的切片帶，一端用鑷子輕輕拉起，應(yīng)盡可能將切片帶拉直展開，用毛筆將切片帶從刀口向上挑起，拉下切片帶，然后輕拖鋪于恒溫水面上。將單張或數(shù)張切片，用鑷子夾住蠟片的一邊并提起，鋪于恒溫水中（光亮的一面朝下），立即用毛筆輕輕拉展，以切片無(wú)皺褶為最好。如有皺褶時(shí)用鑷子細(xì)心地逐個(gè)輕輕撥開，注意不可

5、撥破組織。然后分開每張切片，選取其中最完整的，沒(méi)有皺褶的切片。,貼片（撈片）,待切片在恒溫水內(nèi)充分?jǐn)傞_展平后，將載玻片垂直插入水中，以做過(guò)防脫處理的一面輕靠切片，將玻片直立提起，趁玻片上仍有少量水份時(shí)用毛筆，撥正切片位置。如組織較小，可在玻片上多貼幾片或幾排，但排列應(yīng)密集、整齊。,烤片,用鉛筆在玻片一端的毛玻璃上寫上標(biāo)本編號(hào)，字要寫得小而清楚、端正。將附貼好的切片置于60℃恒溫箱內(nèi)干燥2-8小時(shí)，使切片牢固地貼附于載玻片上即可進(jìn)行染

6、色。,切片的注意事項(xiàng),切片質(zhì)量的好壞，除與技術(shù)熟練程度和切片機(jī)的好壞有關(guān)外，切片刀是決定的因素，刀一定要磨得十分鋒利。否則在切片時(shí)會(huì)自行卷起或皺起，或?qū)⒔M織劃傷出現(xiàn)刀痕，更不能順利地將切片切成連續(xù)地長(zhǎng)條帶狀。切片刀如有缺口存在，將使制成的切片斷裂、破碎，不完整，切片時(shí)應(yīng)時(shí)時(shí)擦凈刀口。切片機(jī)的各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊，否則將會(huì)產(chǎn)生震動(dòng)。在切制切片的開頭階段如出現(xiàn)切制不良與其他故障，最常見的原因是蠟塊或切片刀的松動(dòng)所致。搖動(dòng)切片機(jī)時(shí)，用力要

7、求均勻一致，不宜過(guò)重過(guò)猛，否則可因用力過(guò)重而使機(jī)身震動(dòng)，造成切片厚薄不均。遇有硬化過(guò)度的腦、肝、脾等組織時(shí)，應(yīng)該輕輕切削，以防組織由于震動(dòng)形成空洞現(xiàn)象。在夏秋季節(jié)進(jìn)行切片時(shí)，應(yīng)使用冰塊加強(qiáng)冷卻，這樣不僅可保持石蠟的硬度，同時(shí)也減少了切片的褶皺，給切片制作帶來(lái)方便。,冰凍切片,冰凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。,主要應(yīng)用于：,用于有些水解酶如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等的定位的組織化學(xué)

8、方法以及免疫組織化學(xué)方法等。用于證明脂肪及類脂和神經(jīng)組織髓鞘的染色時(shí)的切片，這常見于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。 用于臨床手術(shù)的快速病理診斷。神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 對(duì)某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。,德國(guó)萊卡恒溫箱冷凍切片機(jī),冷凍切片機(jī)工作原理,這并非特殊類型的切片機(jī)，只不過(guò)組織塊承托臺(tái)改換成急速冷凍（約零下20～3

9、0℃）裝置。這種急速冷凍裝置可以有兩種形式：一為通過(guò)液體CO2，在液體CO2蒸發(fā)時(shí)，急速吸收大量熱而使組織塊很快冷凍。另一種為半導(dǎo)體致冷裝置，借半導(dǎo)體元件電偶作用急速使組織承托臺(tái)降溫，在１～2分鐘內(nèi)也能達(dá)到組織凍結(jié)的目的。須注意的是，制作冰凍切片時(shí)，不但要使組織塊冷凍，同時(shí)還應(yīng)是切片刀冷凍（如利用噴散的多余液體CO2或半導(dǎo)體致冷裝置使刀降溫）。這兩種冷凍裝置以半導(dǎo)體冷凍裝置使用方便，但需電源和水源。,冷凍切片機(jī),該機(jī)的箱面上有電

10、子控制板，裝有即時(shí)冷凍鍵和除霜鍵，啟動(dòng)即時(shí)冷凍鍵，機(jī)器馬上進(jìn)行工作狀態(tài)。啟動(dòng)即時(shí)除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉。有照明鍵一個(gè)，啟動(dòng)該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。 除此之外，箱面的左邊有四個(gè)按鍵，兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退鍵，兩個(gè)為微小進(jìn)退鍵，還有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時(shí)的進(jìn)退。 冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺(tái)，溫度可達(dá)-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺(tái)切片機(jī)，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示

11、出來(lái)。,操作方法及步驟,①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 ③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集

12、的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。,操作方法及步驟,⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過(guò)刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 ⑥應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，

13、肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30℃。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。 如果不做染色，可用固定液固定放于恒冷箱。,冰凍切片的優(yōu)點(diǎn),1．簡(jiǎn)便，可以不需要對(duì)組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。2．快速，用時(shí)短

14、。3．組織變化不大。4．能很好保存脂肪，類脂等成分。5．能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對(duì)于那些對(duì)有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。,冰凍切片的快速染色法,① 切片固定30秒－1分鐘。 ② 水洗。 ③ 染蘇木素3－5分鐘。 ④ 分化。 ⑤ 于堿水中返藍(lán)20秒。 ⑥ 伊紅染色10－20秒。 ⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。 冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分