基于抗生素和重金屬脅迫下的相關(guān)抗性基因的演變過(guò)程研究.pdf

1、近年來(lái)，由于大量抗生素在人類(lèi)醫(yī)藥業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)的濫用導(dǎo)致了大量耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，其攜帶的抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)受到人們普遍關(guān)注。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖尤其是魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素和重金屬的使用沒(méi)有得到有效監(jiān)管，抗生素、重金屬殘留導(dǎo)致抗生素抗性基因（ARGs）和重金屬抗性基因（HMRGs）廣泛存在于養(yǎng)魚(yú)水體中。
　　本論文通過(guò)改變抗生素和重金屬組合及分段添加抗生素和重金屬濃度方式，設(shè)計(jì)1

2、0個(gè)鯽魚(yú)養(yǎng)殖的魚(yú)缸（30cm×20cm×20cm），選擇3種常見(jiàn)的抗生素（四環(huán)素，磺胺嘧啶，頭孢噻肟鈉）和2種重金屬（Cu，Zn）添加到10個(gè)魚(yú)缸中，包括5個(gè)單獨(dú)抗生素和重金屬添加的魚(yú)缸（四環(huán)素、磺胺嘧啶、頭孢噻肟鈉、Cu、Zn），4個(gè)復(fù)合抗生素-重金屬添加的魚(yú)缸（四環(huán)素+磺胺嘧啶+頭孢噻肟鈉、四環(huán)素+磺胺嘧啶、四環(huán)素+磺胺嘧啶+Cu、四環(huán)素+磺胺嘧啶+Zn）以及不添加任何抗生素和重金屬的魚(yú)缸作為空白對(duì)照，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為180天，包括1

3、2個(gè)階段，每15天為一個(gè)階段，探究ARGs和HMRGs在抗生素和重金屬選擇壓力下的產(chǎn)生過(guò)程。采用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction）對(duì)21種ARGs和2種HMRGs定性檢測(cè)，根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)19種ARGs和2種HMRGs進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，同時(shí)測(cè)定各個(gè)魚(yú)缸中3種抗生素和2種重金屬濃度。利用ANOVA（單因素方差分析）分析各個(gè)魚(yú)缸中目標(biāo) ARGs豐度的變化。采用皮爾遜相關(guān)

4、性分析軟件探究環(huán)境脅迫因子與所產(chǎn)生的多種抗性基因之間的相關(guān)性。本研究中的目的基因包括19種ARG（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG，tetM，tetO，tetQ，tetS，tetW，tetX，tetY，sul1，sul2，sul3，blaDHA，blaMOX，blaFOX），2種HMRG（copA，czcA），作為基因標(biāo)準(zhǔn)化衡量指標(biāo)16S-rRNA以及與基因遷移有關(guān)的指示基因1類(lèi)整合子基因（intI1）。

5、>　　結(jié)果表明，添加的抗生素和重金屬在水體中的殘留率分別為0.03％-2.46％和9.25％-52.97％，在相同添加濃度下，重金屬殘留率比抗生素高。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，tetA，tetC，sul1和sul2在相應(yīng)魚(yú)缸中處于主導(dǎo)抗性基因。四環(huán)素類(lèi)抗性基因比磺胺類(lèi)抗性基因及AmpC-β內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗性基因?qū)股鼐哂懈叩拿舾卸?，該?lèi)抗性基因更容易受其相應(yīng)抗生素的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。雙重和三重抗生素脅迫誘導(dǎo)的魚(yú)缸中ARG的總相對(duì)豐度是所有單一抗生素脅

6、迫的魚(yú)缸中總和的1.01-1.55倍，且三重抗生素比雙重抗生素對(duì)ARGs的誘導(dǎo)效應(yīng)更明顯。頭孢噻肟鈉、Zn、Cu的引入對(duì)四環(huán)素+磺胺嘧啶體系中ARGs的豐度和多樣性影響結(jié)果表明，頭孢噻肟鈉與四環(huán)素、磺胺嘧啶復(fù)合比Zn和Cu與其復(fù)合產(chǎn)生的四環(huán)素抗性基因豐度和多樣性更顯著。此外，多變量Peason相關(guān)性分析結(jié)果顯示tetA，tetD，tetS和tetX的豐度與頭孢噻肟鈉實(shí)測(cè)濃度存在顯著相關(guān)性（r=0.912-1.000，p<0.05或p<0