荒漠土壤石油降解菌多樣性、生物學(xué)特性及低溫降解機制.pdf

1、石油開發(fā)和使用過程中造成的環(huán)境污染問題日益明顯，嚴(yán)重威脅人類健康。利用微生物降解來處理石油污染是環(huán)保有效、經(jīng)濟實用的方法之一。論文針對西北荒漠地區(qū)石油污染問題，進(jìn)行污染土壤微生物多樣性分析，篩選出了高效石油降解菌，并進(jìn)行降解菌生物學(xué)特性、降解相關(guān)基因和降解機制研究，將高效石油降解菌應(yīng)用于含油廢水生物處理，主要研究內(nèi)容如下：
　　采用Illumina Miseq高通量測序分析了玉門石油污染荒漠土壤微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)石油污染荒漠土壤中

2、細(xì)菌類群豐富，具有明顯多樣性，包括33門，48綱，78目，179科和471屬。主要優(yōu)勢細(xì)菌類群為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和梭桿菌門（Fusobacteria）。優(yōu)勢菌屬包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、海洋桿菌屬（Oceanobaci

3、llus）、腸球菌屬（Enterococcus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、普氏菌屬（Prevotella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、迪茨氏菌屬（Dietzia）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、奈瑟氏菌屬（Neisseria）、韋永氏球菌屬（

4、Veillonella）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、嗜血肝菌屬（Haemophilus）、梭菌屬（Fusobacterium）、羅氏菌屬（Rothia）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等，其中包括了大部分常見的石油降解菌屬。
　　采用富集培養(yǎng)和涂布平板法從石油污染土壤分離出能利用石油生長的細(xì)菌37株，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)分離的37株細(xì)菌分別屬

5、于放線菌門（Actinobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β變形菌綱（Betaproteobacteria）、芽孢桿菌門（Bacilli）和α變形菌綱（Alphaproteobacteria），歸屬于21屬的34種。優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）、微球菌屬（Micrococcus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、無色桿菌屬（A

6、chromobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus），占分離細(xì)菌總數(shù)的51.35%，有36株細(xì)菌對原油有明顯降解能力。在原油含量為1500 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，8株菌的降解率不低于30.55%，11株菌降解率介于10.05%~28.37%，18株菌降解率不高于8.05%。
　　根據(jù)常見石油降解菌降解相關(guān)基因設(shè)計了特異性引物，利用特異性PCR擴增，檢測了37株菌的降解相關(guān)基因，結(jié)果表明25株細(xì)菌含有烷

7、烴單加氧酶基因，6株含芳烴雙加氧酶基因，6株菌含聯(lián)苯雙加氧酶基因，4株菌含萘雙加氧酶基因，3株菌含甲苯雙加氧酶基因，2株菌含鄰苯二酚雙加氧酶基因。并成功克隆出2種烷烴單加氧酶和1種芳烴雙加氧酶基因。
　　對4株具有高效降解能力的菌株KB1、2182、JC3-47和1217進(jìn)行了生物學(xué)特性及石油降解能力的分析。經(jīng)細(xì)菌形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析，鑒定為紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）、馬紅球

8、菌（Rhodococcus equi）、慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。KB1、2182和JC3-47在溫度10～50℃、pH3～9、0～5.0%NaCl鹽度下生長良好，其中KB1和2182的最適生長溫度為35℃，JC3-47的最適生長溫度為30℃，KB1和2182還可在pH2和9.0%鹽度（w/v）的極端條件下生長，菌株1217生長適應(yīng)性更強，

9、在溫度5～65℃、pH2～10、0～9.0%NaCl鹽度下均可生長，最適生長溫度、pH和鹽度分別為35℃、pH9和0%。4株菌能在以十二烷、十八烷、苯、甲苯、二甲苯和萘為唯一碳源培養(yǎng)基生長，對中鏈及長鏈烷烴都具有較強降解能力，其中 KB1、2182和1217對十六烷具有較強適應(yīng)性，KB1和JC3-47還能在含芘培養(yǎng)基生長，1217能在鄰苯二酚的培養(yǎng)基中生長，均能產(chǎn)生表面活性劑，對十六烷具有一定粘附能力。
　　研究了紅平紅球菌KB1

10、在低溫條件下的生長特性和石油降解情況，結(jié)果表明菌株KB1在總烷烴濃度為10500 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中10℃培養(yǎng)時能較好生長，第5 d菌體數(shù)量達(dá)到最大值，GC-MS分析發(fā)現(xiàn)對總烷烴降解率為64.55%，其中正辛烷29.27%，正癸烷46.25%，正十二烷89.13%，正十四烷77.59%，正十六烷70.35%，正十八烷55.16%，正二十二烷57.38%，正二十四烷67.18%和二十八烷82.64%。
　　進(jìn)行了紅平紅球菌KB1

11、在10℃培養(yǎng)時降解混合烷烴的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與30℃相比，表達(dá)差異明顯的基因有2957條，其中上調(diào)基因1584條，下調(diào)基因1373條。當(dāng)Log2比值>5，上調(diào)基因99條，下調(diào)基因119條，其中33條基因存在于不同細(xì)胞組分中，108條具有分子功能，95條參與了生物學(xué)過程。結(jié)合Go功能富集和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)石油烴降解相關(guān)差異表達(dá)基因201條，包括脂肪酸、芳香化合物、甲烷、萘、二甲苯、乙苯、甲苯和多環(huán)芳烴降解途徑中的差異表達(dá)基因，其中上

12、調(diào)基因135條，下調(diào)基因66條，當(dāng)以Log2比值>5為基準(zhǔn)，參與脂肪酸、芳香化合物、甲烷、萘和乙苯降解的13條基因上調(diào)顯著，有3條基因下調(diào)明顯。
　　采用間歇式活性污泥處理工藝，研究了添加紅平紅球菌KB1在不同溫度下對石油廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)處理20 d后，在10℃和30℃條件下添加KB1的對照組及實驗組出水水質(zhì)的COD分別為58.50、49.32、55.68和45.73 mg/L，NH4+-N含量為7.78、5.52、7.64和

13、6.01 mg/L，TP含量為0.187、0.164、0.232和0.196 mg/L，均達(dá)到石油煉制工業(yè)污染物直接排放要求（GB31570-2015）。在10℃時實驗組出水中原油含量為4.27 mg/L，石油去除率為97.40%，不添加KB1的對照組出水中原油含量為18.75 mg/L，石油去除率為88.58%。30℃條件下實驗組出水中原油含量為3.17 mg/L，石油去除率為98.07%，而對照組出水中原油含量為15.38 mg/L

14、，去除率為90.63%。添加石油降解菌對原油去除有明顯促進(jìn)作用，在低溫條件下仍然有明顯去除效果。
　　以改性和未改性花生殼為吸附原料，研究了其對廢水重金屬離子的吸附作用，發(fā)現(xiàn)改性花生殼對廢水中重金屬吸附效果更明顯，其吸附率在一定范圍內(nèi)與溶液pH、吸附時間、初始離子濃度和吸附劑量呈正相關(guān)。未改性花生殼在酸性條件下吸附率較高，而改性花生殼在堿性條件下吸附率更高，吸附15 min后達(dá)最大吸附率的88%，在50 min時吸附達(dá)到最大，吸附