南極海洋石油烴低溫降解菌的篩選、鑒定及其低溫降解特性研究.pdf

1、南極具有獨(dú)特的地理及氣候特征，其主要特點(diǎn)是變化極大的光照輻射、季節(jié)性的光照時(shí)間。南極海洋系統(tǒng)內(nèi)常年低溫(通常在-1.8℃～2.0℃)，高鹽(海水中的鹽度一般為34‰～35‰，海冰中的鹽囊和鹽通道的鹽度可達(dá)到150‰)，在這樣一個(gè)低溫、強(qiáng)輻射和高鹽度的自然環(huán)境里，海洋微生物必然具備了相應(yīng)獨(dú)特的生理生化和分子機(jī)制，因此，南極微生物不僅是研究在低溫條件下生物適應(yīng)性的極好材料，而且也是獲得低溫生物活性物質(zhì)(低溫酶、PUFA)和其他低溫生物工程菌

2、的最佳來(lái)源。隨著海上油田的開(kāi)采和海洋運(yùn)輸?shù)娜找骖l繁，海洋的石油烴污染越來(lái)越嚴(yán)重，以致被認(rèn)為人類最后一塊凈土的南極大陸也未能幸免。近年來(lái)，南極考察、探礦和觀光旅游的興起，特別是大型油輪的沉沒(méi)，導(dǎo)致大量石油烴泄漏，嚴(yán)重威脅了南極生態(tài)系統(tǒng)的安全，已經(jīng)引起世界各國(guó)的廣泛重視，在南極這樣一個(gè)非常脆弱的生態(tài)系統(tǒng)，任何小的生態(tài)環(huán)境污染，都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生態(tài)系統(tǒng)破壞。生物修復(fù)是消除海洋石油烴污染的重要途徑，本文從南極海水海冰樣品中篩選能低溫降解石油烴的低

3、溫菌，以期為海洋石油烴污染的低溫生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 本文采用MMC無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)和MMC瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)合的方法，從南極海水海冰樣品的細(xì)菌篩選能夠高效低溫降解石油烴的細(xì)菌，對(duì)篩選到的4株南極低溫降解菌進(jìn)行平板生長(zhǎng)和降解率試驗(yàn)；采用16S rRNA分子鑒定方法對(duì)4株南極低溫降解菌進(jìn)行鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；通過(guò)生物搖床進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定南極低溫降解菌NJ49的最適營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)條件；通過(guò)萘低溫降解、柴油低溫降解GC-MS圖譜、脫

4、氫酶試驗(yàn)、產(chǎn)生物表面活性劑試驗(yàn)、脂肪酸變化試驗(yàn)，對(duì)南極低溫降解菌NJ49的降解特性和低溫適應(yīng)性進(jìn)行研究。主要獲得以下結(jié)果： 1.從南極海水海冰樣品中篩選到了4株南極低溫降解菌，即NJ41、NJ44、NJ49、NJ289。平板可見(jiàn)計(jì)數(shù)試驗(yàn)表明，培養(yǎng)20d后NJ41、NJ44、NJ49和NJ289均生長(zhǎng)良好，南極低溫降解菌NJ49菌液細(xì)胞可以接近106.8CFU/ml。對(duì)4株南極低溫降解菌在15℃時(shí)降解試驗(yàn)表明，不同菌株對(duì)柴油的降

5、解能力不同，其中南極低溫降解菌NJ49降解率為最高，可達(dá)68％。 2.對(duì)4株南極低溫降解菌的形態(tài)特征觀察結(jié)果表明，南極低溫降解菌NJ41是球形，其直徑為1.0～1.2μm，其余3株降解菌為桿狀，長(zhǎng)度范圍在0.7～2.8μm之間。4株南極低溫降解菌都不形成芽孢，都具有鞭毛可以運(yùn)動(dòng)。16S rRNA分子鑒定結(jié)果表明：南極低溫降解菌NJ41屬于動(dòng)球菌屬(Planococcus)；南極低溫降解菌NJ49屬于希瓦氏菌屬(Shewanel

6、la)；南極低溫降解菌NJ289是假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)：南極低溫降解菌NJ44有待進(jìn)一步鑒定。 3.對(duì)降解率最高的南極低溫降解菌NJ49在各種不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)以及降解柴油能力的研究結(jié)果表明，其生長(zhǎng)和降解的最適條件為：初始pH為7.5，溫度為15℃，鹽度為6％，搖瓶裝量為80ml，最佳氮源為硝酸銨，最佳磷源為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物。添加表面活性劑能夠促進(jìn)南極低溫降解菌NJ49的生長(zhǎng)和降

7、解，尤其是陰離子表面活性劑(SDS)和非離子表面活性劑(鼠李糖脂)合用，提高了菌株的降解率。 4.對(duì)南極低溫降解菌NJ49的低溫降解特性的研究結(jié)果表明，15℃條件下，它可以在以萘為惟一碳源和能源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并對(duì)萘進(jìn)行降解。采用GC-MS測(cè)定南極低溫降解菌NJ49對(duì)柴油的降解，圖譜表明，對(duì)照柴油中含有C9～C26之間的18種烷烴，而經(jīng)南極低溫降解菌NJ49低溫降解處理后的殘油組分中，僅能檢測(cè)到C15～C217種烷烴，不

8、僅烷烴的種類明顯減少，單一烷烴的含量也減少許多。通過(guò)對(duì)南極低溫降解菌NJ49產(chǎn)脫氫酶試驗(yàn)得知，在5℃時(shí)脫氫酶酶活力要低于15℃時(shí)的酶活力，表明，低溫限定了南極低溫降解菌NJ49的酶活力；補(bǔ)給柴油的MMC培養(yǎng)基中脫氫酶活力高于2216E培養(yǎng)基中的酶活力，推斷測(cè)定的脫氫酶是降解柴油的酶。南極低溫降解菌NJ49的產(chǎn)表面活性劑試驗(yàn)結(jié)果為，在5℃和20℃條件下，該菌均不產(chǎn)生表面活性劑。根據(jù)脂肪酸組成的測(cè)定數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)南極低溫降解菌NJ49在低溫(5

9、℃)降解時(shí)，其脂肪酸組分發(fā)生了變化，不飽和脂肪酸的種類和單種脂肪酸含量均有增加。5℃條件下，南極低溫降解菌NJ49能產(chǎn)生多種不飽和脂肪酸，其含量高于中溫(20℃)條件的。低溫時(shí)，南極低溫降解菌NJ49的脂肪飽和度降低，由1.22降到0.77，推斷該低溫降解菌通過(guò)脂肪酸變化的方式適應(yīng)低溫下的降解。從南極海水海冰中分離到低溫降解石油烴的海洋細(xì)菌在國(guó)內(nèi)尚屬首次，可以認(rèn)為這些南極低溫降解菌為我國(guó)低溫海洋石油污染的生物修復(fù)提供菌源。對(duì)南極低溫降解