百合AG類基因的同源克隆和分析.pdf

1、百合花姿優(yōu)美，是世界鮮切花市場的五大主要產(chǎn)品之一。但在營銷和消費過程中，花粉污染衣物和其他一些有價值的物品一直是一個缺憾。因此，通過調(diào)控百合花發(fā)育相關基因的表達，調(diào)控形態(tài)發(fā)生，改變百合的花器官的結(jié)構(gòu)是近年花卉育種學家探索的重要領域。本研究基于這一基本目標，進行了百合花器官發(fā)育基因調(diào)控有關的基礎研究，并對分子生物學的實驗方法進行了改進。主要結(jié)論如下： 從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的重要前提。百合的植物組織中富

2、含多糖，多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜去除，造成RNA產(chǎn)量的減少，這就使得提取百合的RNA比較困難。本試驗采用了五種方法(CTAB法、TRIZOL法、WI法、GT法和TRIS-SDS法)，對三個百合種試驗材料(鮮切花、卷丹、麝香百合)進行了研究。鮮切花為市售東方百合產(chǎn)品，購回后用液氮冷萃后，-70℃保存?zhèn)溆?。卷丹和麝香百合為實驗室種質(zhì)資源圃中收集的材料，開花時直接從植株上采下，于液氮

3、冷萃后，-70℃保存?zhèn)溆谩?試驗結(jié)果顯示，CTAB、TRIZOL和WI法均不適合百合RNA的提取，TRIZOL法雖然操作簡單，步驟少，但是得到的RNA不純；CTAB法用于提取鮮切花根本提取不到RNA，用于提取卷丹和麝香百合時，也出現(xiàn)不同程度的降解；GT法雖然適合百合的提取，但是操作復雜，而且得到的RNA含量不高，效率很低。TRIS-SDS法既能提取到高質(zhì)量的RNA，也能高效提取，并對不同品種的百合有普遍的通用性。經(jīng)過改進的TRI

4、S-SDS法，操作也比較簡便，試驗中一些試劑都可以自己配制，降低了試驗費用。 參照單子葉植物的AG類基因序列設計簡并引物，利用RT-PCR的方法，從百合中擴增AG到同源片段，并根據(jù)擴增出的片段序列設計特異引物進行5'RACE和3'RACE的擴增，最終獲得全長。本試驗從百合中克隆得到了2個近全長的花發(fā)育相關基因片段LLAGM1，2，它們都屬于MADSbox基因家族，并和AG類基因有較高的同源性。 LLAGM1全長1000b

5、p，編碼243個氨基酸。LLAGM1的氨基酸序列與擬南芥AG的同源性為68.5％，與榛子CaMADS1的同源性為68.5％，與風信子HAG的同源性為73％，與百合LLAG1同源性為92.2％，與水稻OsMADS3的同源性為68.2％，與姬蝴蝶蘭PeMADS1的同源性為71％，與矮牽牛pMADS3的同源性為68.8％。氨基酸序列比較可以看出，LLAGM1和LLAG1的M區(qū)完全相同，但是在K區(qū)存在18個不同的氨基酸序列，在C端有兩個不同的氨

6、基酸。 LLAGM2全長1168bp，編碼249個氨基酸。LLAGM2與多種植物的AG類基因同源性較高。LLAGM1的氨基酸序列與擬南芥AG的同源性為64.1％，與榛子CaMADS1的同源性為64.6％，與風信子HAG的同源性為68.6％，與百合LLAG1同源性為86.5％，與水稻0sMADS3的同源性為63.6％，與姬蝴蝶蘭PeMADS1的同源性為68％，與矮牽牛pMADS3的同源性為65.3％。LLAGM2與LLAG1在K區(qū)