基于玉米基因組特定BAC跨疊群序列定位Rf3基因.pdf

1、玉米不僅是世界上重要的糧食作物和飼料作物，也是植物遺傳學研究的重要模式植物。玉米基因組學研究是分子生物學的前沿領域，玉米自交系B73全基因組序列草圖的公布大大促進了玉米功能基因組學研究，為研究玉米基因組結構及基因克隆奠定了良好基礎。BAC文庫的發(fā)展，特別是玉米自交系B73的BAC文庫的建立，BAC測序工作及序列的公布，為物理作圖、開發(fā)分子標記進行基因定位、基因圖位克隆提供了有效工具。
　　 植物雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎，CM

2、S/Rf系統(tǒng)為實踐中雜交種的生產提供了便利。玉米CMSL/Rf系統(tǒng)是世界上最早應用于雜種優(yōu)勢育種的系統(tǒng)之一。S-CMS是玉米細胞質雄性不育中最大的一組，但育性表現(xiàn)不穩(wěn)定，影響了其在育種中的應用。克隆其恢復基因Rf3對充分發(fā)揮其在雜種優(yōu)勢中的利用尤為重要。前人已對Rf3基因進行了定位，但目前還無法滿足圖位克隆的需要。
　　 本研究在本室前期對玉米S-CMS研究基礎上，以近等基因系S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3為

3、材料，結合SSR、STS分子標記開發(fā)技術，利用Rf3基因區(qū)段的BAC序列信息，在對此區(qū)域序列進行分析的基礎上，對Rf3基因進行精細定位，篩選與其緊密連鎖的分子標記，建立Rf3的緊密遺傳連鎖圖譜，獲得主要研究結果如下：
　　 1．利用近等基因系S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3構建了回交一代BC1F1群體（S-Mol7Rf3Rf3×S-Mol7Rf3Rf3）×N-Mol7Rf3Rf3。對所有單株進行田間育性及花粉鏡

4、檢，二者的結果一致，且不育株與半不育株比例為2720：2781，符合1：1。在本研究中該育性恢復性狀是受一對基因控制的，排除了背景的影響。
　　 2．利用Rf3基因所在2.09bin區(qū)域的標記UMC2184、SCARE12M7對Rf3進行初定位，并作為其它標記的錨定位點，據此確定Rf3基因位于跨疊群Contig108中。
　　 3．利用Rep3eat Masker軟件對Contig108中78個BAC序列進行重復序列分析

5、，發(fā)現(xiàn)有62.82％為重復序列。重復序列中92.62％為逆轉座子，而其中LTR數量最多，占逆轉座子的89.29％。LTR中Gypsy/DIRS1占46.46％，Ty1/Copia占39.22％。這一結果與前人對玉米基因組結構的預測基本相符，說明通過對BAC序列分析，可以對全基因組結構進行初步了解。
　　 4．利用SSRScan軟件和SSPIT軟件對不含重復序列（未屏蔽簡單重復序列）的BAC序列進行SSR序列分析，共發(fā)現(xiàn)221個S

6、SR序列，平均約60.0kb就有一個，與前人研究相符。
　　 5．利用Clemson大學提供的在線整合服務平臺開發(fā)SSR標記，共合成了63對引物，其中有22對在親本S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3間有多態(tài)性，開發(fā)效率為35％。本研究利用其中的9個SSR標記用于Rf3基因的精細定位，其中最近的為標記N7和N8，它們位于Rf3基因兩側，距Rf3基因均為1.7cM。
　　 6．根據SSR標記初步定位結果，在目

7、標BAC中開發(fā)STS標記。將目的區(qū)段分為亞區(qū)，設計了153對引物，其中5對在親本S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3間有多態(tài)性，開發(fā)效率為3.3％，本研究利用其中4對對Rf3基因精細定位，其中標記N10、N11與N8共分離，距Rf3基因1.7cM；標記N9、N12共分離，與Rf3基因距離為0.7cM。
　　 7．用FGENESH軟件對BAC序列進行基因預測，用Blastp及InterProScan軟件進行基因注釋，

8、共有406個預測基因被注釋，其中有16個含有PPR結構域，它們位于8個BAC中。但這8個BAC中7個BAC含有的PPR結構域與水稻恢復基因Rf-1有關，說明此區(qū)域與育性恢復存在一定的相關性，且Rf3可能與Rf-1有同源性。另外，發(fā)現(xiàn)Rf3基因定位所在的兩個BAC中均不含有編碼PPR結構域的基因。對BAC序列和線粒體基因組進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)這兩個BAC與線粒體基因組高度同源。這一結果證實了Rf3基因定位結果且說明建立自交系Mol7的BA