蘋(píng)果早期落葉病生物防治關(guān)鍵技術(shù)研究及其田間應(yīng)用.pdf

1、目前，蘋(píng)果早期落葉病已成為我國(guó)蘋(píng)果生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，在我國(guó)各蘋(píng)果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)病率逐年上升，直接影響蘋(píng)果的產(chǎn)量和質(zhì)量，危害巨大。本研究對(duì)廣譜拮抗菌株分離篩選、菌株分類(lèi)鑒定、拮抗菌株對(duì)病原菌的抑制作用、抑菌物質(zhì)的分離純化和研究、發(fā)酵工藝優(yōu)化和田間防治等蘋(píng)果早期落葉病生物防治關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，以期為蘋(píng)果早期落葉病的生物防治提供理論依據(jù)和奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，旨在探索一條綠色高效、可持續(xù)的蘋(píng)果早期落葉病病害防治途徑。 采用

2、稀釋分離法從不同來(lái)源的11份樣品中分離純化得到細(xì)菌菌株173株，以8種植物病原菌為靶標(biāo)、采用平板對(duì)峙法、以抑菌效果明顯和菌株生長(zhǎng)迅速為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行植物病害廣譜拮抗菌株的篩選，共篩選得到廣譜拮抗菌株20株，其中有7株菌株對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌(Alternaria alternata f．sp． Mali)和蘋(píng)果褐斑病病原菌(Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis)均有明顯抑制作用。然后以Alt

3、ernaria alternata f．sp． Mali和Marssonina coronaria(EIl Et Davis) Davis為靶標(biāo)、采用平皿葉片法，對(duì)7株廣譜拮抗菌株進(jìn)行蘋(píng)果早期落葉病廣譜拮抗菌株的復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果顯示菌株BS24和菌株D4的抑制效果最好，病葉抑制率分別為100％和90.48％。 結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)菌分類(lèi)鑒定方法和16S rDNA序列分析對(duì)拮抗菌株BS24和D4進(jìn)行分類(lèi)鑒定，結(jié)果表明菌株BS24應(yīng)為枯草芽孢桿

4、菌和菌株D4應(yīng)為巨大芽孢桿菌，Genbank登錄號(hào)分別為GQ213991和FJ755786。 研究了拮抗菌株BS24對(duì)病原菌的作用方式。菌株BS24可顯著抑制Alternaria alternata f．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis的菌絲生長(zhǎng)，抑菌帶寬度分別為9.5 mm和9.2 mm；可在蘋(píng)果葉片上迅速定殖、占據(jù)生存空間，使病原菌無(wú)法在葉片上定殖，從而有效地

5、阻斷了病原菌對(duì)蘋(píng)果葉片的侵染。菌株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)濾液同樣可明顯抑制病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)Alternaria alternata f．sp． Mali和Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis的抑制率分別為85.48％和82.86％；可使病原菌菌絲生長(zhǎng)畸形，出現(xiàn)扭曲變形、明顯交聯(lián)、部分部位斷裂、細(xì)胞質(zhì)聚集以及內(nèi)含物外溢等現(xiàn)象；還可導(dǎo)致芽管生長(zhǎng)畸形，明顯抑制病原菌分生孢子的萌發(fā)。通過(guò)酸沉淀、甲醇抽提和RP—H

6、PLC等步驟，分離得到抑菌物質(zhì)BSP，經(jīng)研究初步確定其為一個(gè)小分子抑菌多肽。BSP抑菌譜較廣，對(duì)Alternaria alternata f．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis) Davis、Phyllostictapirina、Bolyosphoma berengeriana、Fusarim oxysporium f． sp． Melonis、Glanerella cingulata、

7、Alternaria alternata fries Keissler和Alternaria solani等病原真菌和Escherichia coli均具有抑菌活性，其中對(duì)Alternaria alternata F．sp． Mali、Marssonina coronaria(Ell Et Davis)Davis的EC50分別為5.03μg/mL和5.60μg/mL。BSP具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性。菌株BS24可分泌

8、胞外蛋白酶。 綜合考慮工業(yè)化生產(chǎn)要求，以發(fā)酵液活菌數(shù)為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，從6種供試發(fā)酵培養(yǎng)基中選出初始發(fā)酵培養(yǎng)基。采用Plackett—Burman設(shè)計(jì)法、最陡爬坡試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，得到擬合良好的回歸方程，R2=0.96。模型驗(yàn)證顯示預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較好的擬合性，預(yù)測(cè)模型可靠。未優(yōu)化前發(fā)酵液活菌數(shù)為8.6×109 cfu/mL，優(yōu)化后為l5.08×109 cfu/mL，增加了75.35％。優(yōu)化后發(fā)酵工藝為淀粉1

9、.5 g，黃豆粉2.16 g，酵母膏0.3 g，蔗糖0.5 g，尿素0.2 g，MnSO40.01 g，MgSO40.01 g，K2HPO40.2 g，蒸餾水100 mL，pH7.0．轉(zhuǎn)速300 r/min，接種量7.8％。 田間試驗(yàn)結(jié)果表明：拮抗菌劑三個(gè)不同濃度的處理均對(duì)蘋(píng)果早期落葉病有較好的防治效果，拮抗菌劑原液、拮抗菌劑50倍液和拮抗菌劑100倍液防治效果分別為83.14％、79.21％和76.99％，均顯著高于10％多抗