豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分離鑒定及滅活疫苗的研究與應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染是近些年新發(fā)現(xiàn)的豬的傳染病，主要包括斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、懷孕母豬繁殖障礙（SAMS）、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾病（PRDS）、豬皮炎和腎炎綜合征（PDNS）、幼齡仔豬A2型先天性震顫（CT）、間質(zhì)性肺炎（IP）、增生性壞死性肺炎（PNP）等。PCV2感染能降低豬體免疫力，常引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染，加重病情。該病在世界許多國(guó)家和地區(qū)的廣泛流行，已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響著世

2、界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
　　 本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬2型圓環(huán)病毒（PCV）基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2特異性引物。利用PCR方法，對(duì)湖北省18個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（PMWS）的258頭病豬的淋巴結(jié)、脾臟組織進(jìn)行PCR檢測(cè)。檢測(cè)到陽(yáng)性病例170份，陽(yáng)性檢出率為65.8％，說(shuō)明該病在湖北省普遍存在。
　　 1．將PCR檢測(cè)陽(yáng)性病料組織研磨、離心、過(guò)濾除菌，接種到無(wú)PCV1型污染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行

3、分離。病毒在PK-15細(xì)胞上盲傳6代后，提取病毒DNA，利用PCV2特異性引物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得陽(yáng)性結(jié)果，表明PCV2在無(wú)PCV1污染的PK-15細(xì)胞中增殖培養(yǎng)成功。用ORF2單抗間接免疫熒光試驗(yàn)可觀察到PCV2特異性免疫熒光。由此說(shuō)明，分離出的病毒為豬圓環(huán)病毒2型，分別命名為PCV2WH株、HT株和HB株。
　　 對(duì)分離的三株P(guān)CV2毒株進(jìn)行序列分析。測(cè)序結(jié)果表明：分離到的3株P(guān)CV2的ORF2基因大小相同，都為

4、702 bp；其核苷酸與參考毒株的同源性為98.2％～99.7％，氨基酸同源性為81.2％'97.4％；本研究分離的3株同源性為99.5％～99.7％；3株湖北分離毒株與國(guó)內(nèi)其他省份的分離株的親緣關(guān)系較近，同源性為98.2％～99.1％，處在同一條大的分支上。
　　 2．本研究針對(duì)分離鑒定的PCV2-WH株通過(guò)四種不同的方法進(jìn)行病毒增殖優(yōu)化培養(yǎng)：（1）細(xì)胞與病毒同步接種并用300 mm的D-氨基葡萄糖處理；（2）同步接種不用D-

5、氨基葡萄糖處理；（3）不同步接種并用D-氨基葡萄糖處理；（4）不同步接種不用D-氨基葡萄糖處理。通過(guò)傳統(tǒng)PCR和熒光定量PCR檢測(cè)病毒增殖結(jié)果表明：同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的病毒含量比其他三種培養(yǎng)工藝所獲病毒量分別提高了12.8％，14.7％，56.7％。第二代中，同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的病毒含量比其他三種培養(yǎng)工藝所獲病毒量分別提高了55.8％，85.3％，73.3％。因此，在體外培養(yǎng)條件下，獲得最大PCV2滴度的方法就是

6、采取同步接種并用D-氨基葡萄糖處理的工藝。
　　 3．疫苗的制備與應(yīng)用。針對(duì)目前豬2型圓環(huán)病毒疫苗已在預(yù)防PCV2上發(fā)揮了顯著的效果。部分進(jìn)口商品化PCV2疫苗逐漸走進(jìn)我國(guó)市場(chǎng)，我國(guó)各科研單位也正在自主研發(fā)國(guó)產(chǎn)化的PCV2疫苗。本研究將分離鑒定的PCV2-WH毒株在PK-15細(xì)胞上增殖，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)獲得較高滴度病毒作為抗原，制備了全病毒油乳劑滅活疫苗，對(duì)國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)體系對(duì)口試驗(yàn)站的一些規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行了田間試驗(yàn)，對(duì)4-5周齡的仔豬