副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(HPS)引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎,隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，但目前仍沒(méi)有對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究對(duì)副豬嗜血桿菌的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷方法和滅活疫苗進(jìn)行研究，為我國(guó)副豬嗜血桿菌病的基礎(chǔ)研究以及我國(guó)對(duì)于該病的診斷、預(yù)防與控制奠定基礎(chǔ)，主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及關(guān)于我國(guó)的病原學(xué)調(diào)查 從全國(guó)十五個(gè)

2、省市送本室檢測(cè)的疑似患多發(fā)漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎的病料中分離到281株細(xì)菌，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性及PCR鑒定最終確定為副豬嗜血桿菌。對(duì)從2003年6月到2004年12月送我室檢測(cè)的828例病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果有183例分離出副豬嗜血桿菌，分離率高達(dá)22.1％，表明該菌在我國(guó)廣泛流行。對(duì)本室分離的所有副豬嗜血桿菌按瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)血清學(xué)分型方法進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果表明我國(guó)以血清4型(24.2％)和5型(19.2

3、％)最為流行，其次為13型(12.5％)、14型(7.1％)和12型(6.8％)，另外有12.1％的分離菌株不能進(jìn)行血清學(xué)分型。該結(jié)果為我國(guó)對(duì)于副豬嗜血桿菌病的預(yù)防與控制提供了參考依據(jù)。 2.副豬嗜血桿菌生物學(xué)特性的研究 以本室分離鑒定的副豬嗜血桿菌MD0322株和SH0165株為代表菌株對(duì)該菌的各種生物學(xué)特性進(jìn)行研究。對(duì)不同固體培養(yǎng)基的比較發(fā)現(xiàn)該菌在TSA固體培養(yǎng)基和TM／SN固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，對(duì)不同液體培養(yǎng)基的比

4、較發(fā)現(xiàn)該菌在TSB液體培養(yǎng)基、TMB液體培養(yǎng)基和BHI液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。副豬嗜血桿菌在’TSB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線顯示培養(yǎng)16～18h活菌數(shù)達(dá)到最高峰，隨后大幅下降。副豬嗜血桿菌在生理鹽水、磷酸鹽緩沖液和TSB液體培基中4℃保存的存活曲線顯示該菌在以上介質(zhì)中每保存一天時(shí)間其活菌數(shù)均要下降一個(gè)對(duì)數(shù)值左右，說(shuō)明副豬嗜血桿菌通常不能采用單純的平板菌落計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)。本研究提出的分光光度計(jì)測(cè)定法合理地解決了副豬嗜血桿菌即時(shí)計(jì)數(shù)的問(wèn)題，為該

5、菌各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。 3.副豬嗜血桿菌抗體間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立及我國(guó)血清學(xué)調(diào)查 將副豬嗜血桿菌經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化鞣酸化紅細(xì)胞，建立間接血凝試驗(yàn)用于檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體。采用該法對(duì)副豬嗜血桿菌15種血清型標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性；對(duì)豬瘟、口蹄疫、圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒、豬偽狂犬、豬繁殖與呼吸綜合征、豬氣喘病、豬鏈球菌、豬肺疫巴氏桿菌、豬傳染性萎縮性鼻炎及胸膜肺炎等病原的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的檢測(cè)

6、結(jié)果全為陰性，具有良好的特異性。本檢測(cè)方法最低可檢測(cè)出1:2<'11>倍稀釋的高免血清，具有良好的敏感性。按本方法制備的間接血凝診斷試劑保存期可達(dá)6個(gè)月。本研究為副豬嗜血桿菌抗體的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)捷、靈敏和特異的方法。采用該間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)方法從2005年3月到2005年12月對(duì)全國(guó)七個(gè)省份共血清1665份的抽檢結(jié)果陽(yáng)性784份，陰性881份，陽(yáng)性率47.1％，從抗體方面表明副豬嗜血桿菌病在我國(guó)各地流行較普遍。 4．副豬嗜血桿菌

7、病滅活疫苗的研究 4．1副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢驗(yàn)用菌株的篩選 根據(jù)本室完成的副豬嗜血桿菌流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，以我國(guó)最流行的血清4型和5型菌株研制疫苗，通過(guò)對(duì)臨床資料及動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的比較篩選出毒力較強(qiáng)，免疫原性較好的菌株即血清4型MD0322株和血清5型SH0165株作為疫苗候選菌株，毒力穩(wěn)定性和免疫原性穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明兩株菌種連傳25代后仍保持穩(wěn)定，因而最終確定這兩株細(xì)菌作為副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢

8、驗(yàn)用菌株。 4．2副豬嗜血桿菌病滅活疫苗基礎(chǔ)菌種的研究 按照《中國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求建立用于副豬嗜血桿菌病滅活疫苗制備與檢驗(yàn)用菌株的基礎(chǔ)種子，對(duì)基礎(chǔ)菌種的形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特征、血清型、毒力、免疫原性、毒力穩(wěn)定性和免疫原性穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。結(jié)果表明基礎(chǔ)菌種在方面均符合副豬嗜血桿菌的特征，MD0322株為血清4型，SH0165株為血清5型，基礎(chǔ)菌種純粹檢驗(yàn)無(wú)雜菌生長(zhǎng)，兩株菌種連代25代以后的毒力和免疫原性均保持穩(wěn)

9、定不變，在各方面完全符合基礎(chǔ)菌種的要求。 4．3副豬嗜血桿菌病滅活疫苗安全性試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)室試制五批副豬嗜血桿菌病滅活疫苗，批號(hào)依次為0301、0302、0303、0304、0305。通過(guò)對(duì)最小使用日齡靶動(dòng)物接種、對(duì)靶動(dòng)物各種接種途徑一次單劑量接種，對(duì)靶動(dòng)物單劑量重復(fù)接種，對(duì)靶動(dòng)物一次超劑量接種以及對(duì)懷孕動(dòng)物(妊娠母豬)接種后觀察其精神狀態(tài)，體溫和食欲等指標(biāo)對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該疫苗用于豬的免疫是安

10、全的，無(wú)副作用。 4．4四種副豬嗜血桿菌病滅活疫苗對(duì)仔豬免疫效力的比較 用副豬嗜血桿菌MD0322株和SH0165株兩株菌種分別制備副豬嗜血桿菌病單價(jià)滅活疫苗。將兩種單價(jià)滅活疫苗與本室試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(雙價(jià))，以及國(guó)外生產(chǎn)的兩種副豬嗜血桿菌病滅活疫苗相比較，每種滅活疫苗分別免疫28～35日齡仔豬10頭，21日后二免，同時(shí)設(shè)立10頭未免疫對(duì)照。二免后14日，分別用血清4型和5型標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)腹腔內(nèi)攻毒，

11、結(jié)果兩種單價(jià)疫苗的保護(hù)率均為4／5，本室試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗總的保護(hù)率為9／10，兩種進(jìn)口疫苗的總保護(hù)率分別為8／10(疫苗含血清4型和5型菌)和5／10(疫苗含血清2型和6型菌)。 4．5副豬嗜血桿菌病滅活疫苗效力試驗(yàn) 通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)試制的五批副豬嗜血桿菌病滅活疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)。每批選擇28～35日齡斷奶仔豬20頭，每批疫苗免疫10頭豬，另外10頭作為對(duì)照。在二免后14日分別用MD0322株和SH0

12、165株通過(guò)腹腔內(nèi)攻毒，結(jié)果免疫豬保護(hù)率均在4/5以上，對(duì)照組發(fā)病率均在3/5以上，表明試制的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗具有良好的免疫效果。 4.6副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的免疫期及抗體消長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定 用本室試制的五批滅活疫苗對(duì)其免疫期和免疫豬的抗體消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行研究。五批疫苗按常規(guī)免疫劑量分別對(duì)母豬和14日齡仔豬免疫，于免疫后7、14、28、60、90、120、150、180、2lO日采血測(cè)定抗體。結(jié)果在疫苗免疫后2周開(kāi)始檢測(cè)出

13、抗體，以后抗體效價(jià)逐漸上升，60～120日處于高峰，以后逐漸下降，持續(xù)至免疫后180日。母豬免疫后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律與仔豬的抗體消長(zhǎng)規(guī)律基本一致，但抗體效價(jià)高于仔豬。表明副豬嗜血桿菌病滅活疫苗加強(qiáng)免疫后的免疫期可達(dá)6個(gè)月。 4.7副豬嗜血桿菌母源抗體與仔豬免疫的相關(guān)性 將試驗(yàn)仔豬分成4組，每組10頭。第1組仔豬為未免疫母豬所產(chǎn)，并且仔豬未免疫；第2組仔豬為未免疫母豬所產(chǎn)，但仔豬實(shí)行免疫；第3組仔豬為免疫母豬所產(chǎn)，但仔豬未免疫

14、；第4組仔豬為免疫母豬所產(chǎn)的仔豬，并且仔豬實(shí)行免疫。分別在仔豬出生后第2、7、14、21、28、35、42和48日采血用間接血凝試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定血清抗體效價(jià)。通過(guò)對(duì)抗體檢測(cè)結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)母源抗體水平在免疫母豬所產(chǎn)仔豬顯著高于非免疫組母豬所產(chǎn)仔豬。另一方面，免疫母豬和非免疫母豬所產(chǎn)仔豬在免疫后所激發(fā)的抗體水平?jīng)]有顯著差異，表明母源抗體對(duì)仔豬的免疫不存在影響。 4.8副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的保存期試驗(yàn) 本室試制的五批疫