H9N2亞型流感病毒HA基因變異分析及對雞免疫機能的影響.pdf

1、禽流行性感冒，簡稱禽流感(Avian Influenza，AI)，是由正粘病毒科、正粘病毒屬A 型流感病毒所引起的禽類的感染和/或疾病綜合征。自1994年首次報道H9N2 亞型禽流感在中國的流行以來，已有多位學(xué)者先后從不同地區(qū)的患病雞群中分離到相同亞型的禽流感病毒。從已有的報道分析，H9N2 亞型禽流感病毒已成為中國當(dāng)前禽流感病毒的主型，并且對養(yǎng)禽業(yè)的危害越來越嚴(yán)重，尤其是它與公共衛(wèi)生方面的某些聯(lián)系，更激起了人們對它的廣泛興趣。鑒于HA

2、基因在病毒吸附、穿膜過程以及病毒的致病力方面均起著關(guān)鍵作用，開展對H9N2 亞型禽流感病毒的HA基因變異分析及對其免疫抑制作用的研究，無論在病毒學(xué)還是獸醫(yī)學(xué)方面均有重要的意義。
　　 1、H9N2 亞型禽流感病毒的分離、鑒定及HA基因變異分析本試驗采集了2007-2010年山東省泰安、濰坊、煙臺等12個地區(qū)35個商品代肉雞雞場不同季節(jié)疑似H9N2 亞型流感病毒感染的500多份病料，進行了病毒的分離、鑒定，并對分離所得的12 株病

3、毒進行了HA基因測序及序列分析。結(jié)果表明不同地區(qū)所分離的12 株禽流感病毒同源性較高，核苷酸同源性在91.5-99.9％之間，氨基酸同源性在90.6％-100％之間。HA基因序列比對結(jié)果顯示，與2007年福建分離株和1999年山東分離株同源性均較高，核苷酸同源性分別為93.2％-96.9％和92.4％-99.5％，推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為91.2％-98.6％和87.8％-99.1％。與國外分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，如2000、2003、2

4、008 韓國分離株、2002年伊朗和沙特阿拉伯分離株、2004年北印度和西印度分離株等，其中與2008年韓國分離株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，核苷酸同源性僅為81.1％-83.3％，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為74.5％-85.1％。同時，12 株分離株與EU939143 2007年山東H9N2亞型流感病毒分離株進行了同源性比對，核苷酸和氨基酸同源性分別為90.2％-94.5％和87.3％-94.8％，此株病毒與歐亞代表毒株C/BJ/1/94 同源性93.

5、4％。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，12 株分離株與07 山東分離株同屬于歐亞種系中的類CKBJ1/94 亞系。12個毒株的裂解位點（335-341aa）的氨基酸序列均為RSSR↓GLF，符合低致病性禽流感裂解位點的氨基酸序列特征。但是核苷酸分析表明，有3個分離毒株的337位為絲氨酸，其相應(yīng)的核苷酸分別為AGT和AGC，它們都有可能突變?yōu)锳GA，即絲氨酸變?yōu)榫彼?，從而使裂解位點成為高致病性禽流感病毒的特征序列（RPK-X-K/R-R）。5

6、株分離株234位受體結(jié)合位點由Q 變異為L，與香港人源H9N2 毒株此處氨基酸相同，但是第226位受體結(jié)合位點為Q，不易感染人。2、H9N2 亞型禽流感病毒對雞免疫機能的影響選擇毒假中等的H9N2 亞型禽流感病毒SD06分離株對SPF 雞進行了攻毒試驗，探討H9N2 亞型禽流感病毒SD06 株對雞免疫機能的影響。首先將200 只SPF 雞隨機均分為A、B兩組，隔離飼養(yǎng)。A 攻毒組，B 為不接種病毒對照組。B組于8日齡經(jīng)點眼滴鼻人工感染H

7、9N2 亞型禽流感病毒SD06 株，攻毒劑量為0.4 mL/只（EID50 為10-7.38/0.1mL）。攻毒后7、14、21、28、35d，A、B兩組隨機選取10 羽，剖殺采集氣管、肺臟、脾臟等組織，利用熒光定量RT-PCR 方法檢測H9N2 禽流感病毒在不同組織、不同時間在感染雞中的載量及復(fù)制情況。攻毒后每隔4 d 隨機剖殺5 只，采集肺臟、脾臟、法氏囊、腎臟、胰腺、腦等組織固定，常規(guī)H.E.染色觀察免疫器官的病理變化，并利用間接

8、免疫熒光染色對病毒進行抗原定位。同時在攻毒后7、14、21、28、35d 隨機抽取10 羽稱取活重，采集血樣，進行Annexin V-FITC/PI 標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測T 淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞凋亡、P53和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平情況；剖檢分離胸腺、法氏囊、脾臟并稱重，計算免疫器官指數(shù)。然后將另外200 只雞隨機分成C（C1、C2、C3）、D 四組，在14d和21d 免疫新城疫疫苗，C1、C2、C3 為不同劑量攻毒組，攻毒劑量分

9、別為0.2 mL/只、0.4 mL/只、0.6 mL/只，于8日齡攻毒，攻毒后7、14、21、28、35d，隨機取10 羽采集血樣，分離血清，測定血清中抗NDV 血凝抑制抗體滴度，繪制抗體消長曲線，了解流感病毒對新城疫疫苗抗體水平的影響。
　　 SPF 雞于攻毒后3d 開始發(fā)病，發(fā)病雞表現(xiàn)體溫升高、精神沉郁，前期流漿液性帶泡沫的眼淚，后期流黃白色膿性分泌物等癥狀。部分雞心冠脂肪、肺臟、脾臟等可見出血點。采用SYBR Green

10、I 嵌合型熒光染料與雙鏈DNA 結(jié)合后發(fā)出熒光，通過檢測反應(yīng)體系中熒光強度，表明攻毒后7-14 d以氣管中病毒含量最高，隨后21 d后肺臟以及脾臟中的病毒含量開始升高，并以肺臟中病毒含量最高。攻毒7 d后（15日齡）及14 d（22日齡），免疫器官指數(shù)下降尤為明顯，病理組織學(xué)檢測結(jié)果顯示胸腺、法氏囊退化及脾小體的充血、出血。經(jīng)熒光染色，發(fā)病雞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H9N2 亞型流感病毒后14d，CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞均比對照組

11、降低，CD4+/CD8+比值也明顯下降，與對照組比較差異顯著；Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況顯示，攻毒后促進淋巴細(xì)胞早期凋亡；血液淋巴細(xì)胞內(nèi)P53 mRNA表達(dá)水平上升，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下降；攻毒組抗NDV的HI 抗體滴度較對照組明顯下降。
　　 綜上所述，近3年來山東地區(qū)分離到的H9N2 流感病毒HA基因序列變異較小。對SPF 雞的相關(guān)試驗研究結(jié)果表明，H9N2 亞型禽流感病毒感染，可使