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文檔簡介
1、斷奶仔豬腹瀉和豬水腫病是由產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)引起的一種常見且重要的細菌性傳染病,易與其它病原菌、病毒并發(fā)或繼發(fā)感染,給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。引起斷奶仔豬腹瀉和豬水腫病的大腸桿菌國外報道的血清型主要有O139、O138、O141、O8、O157、O45等。
STEC是革蘭氏陰性菌,其細胞壁中含有脂質(zhì)雙分子層。細胞壁的內(nèi)膜主要
2、由磷脂構(gòu)成而外壁層主要由磷脂和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構(gòu)成。LPS由類脂A、核心多糖和O-特異性多糖三部分組成。類脂A中長脂肪鏈的緊密疊加以及LPS的疏水部共同形成了細菌的通透性屏障。類脂A在革蘭氏陰性菌的致病性方面起重要作用。它可以激活體內(nèi)的內(nèi)在免疫系統(tǒng),使陽離子抗菌肽、細胞因子、凝固因子以及其他免疫刺激因子的合成增多。類脂A包含四條(R)-3-hydroxyacy主鏈,其中某些(R)-3-hydroxy
3、acy鏈可以進一步乙?;揎?。LpxL和LpxM在大腸桿菌類脂A分子生物合成的最后一步中起重要作用,這一步發(fā)生于細菌細胞壁的內(nèi)壁層。在正常溫度下,細菌在?;铣赊D(zhuǎn)移酶的作用下將月桂酰和肉豆蔻酰連續(xù)不斷地添加到四?;a(chǎn)物中間體上。但是,在12℃低溫環(huán)境時,酰基合成轉(zhuǎn)移酶LpxP代替LpxL發(fā)揮作用,從而使鏈結(jié)合軟脂酮。LpxL和LpxM基因的突變使細菌的致病力及對吞噬細胞的抵抗力均降低。
本研究運用等位基因交換的方法構(gòu)建Lp
4、xL的單基因突變株和LpxLLpxM雙基因缺失突變株以及LpxLLpxMLpxP三重突變株。PCR擴增帶有酶切位點的LpxL、LpxM和LpxP基因片段并將其插入到pMD18-Tsimple載體中相應酶切位點處,再運用分子克隆的方法將Cam抗性基因分別插入到目的基因LpxL、LpxM和LpxP中,構(gòu)建出帶Cam抗性基因標志的載體pT-LpxL-Cam、pT-LpxM-Cam和pT-LpxP-Cam。PCR擴增片段LpxL-Cam、Lpx
5、M-Cam和LpxP-Cam,并電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的豬病原性大腸桿菌分離株O141和O8中,在Red重組系統(tǒng)中質(zhì)粒pKD46表達的重組酶的幫助下,篩選出O141及O8株的基因突變株O141△LpxL△LpxM△LpxP、O8△Lpx△LpxM△Lpx,并在pCP20的作用下去除Cam抗性。
Southernblot結(jié)果顯示FRT位點基因在STECO141及O8株的基因組中的插入是單拷貝的;RT-PCR結(jié)果表明突變株
6、的LpxL、LpxM和LpxP基因不能轉(zhuǎn)錄,而其上下游基因的轉(zhuǎn)錄未受到影響。體外生長曲線的測定結(jié)果表明O14△LpxL△LpxM△LpxP、O8△LpxL△LpxM△LpxP突變株的生長速率與野生株相比明顯減慢。
本研究制備了基因缺失株的滅活菌,并對其在小鼠體內(nèi)誘導體液免疫及其對強毒株攻擊后的免疫保護力等方面進行了研究,為PWD和ED基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。將已構(gòu)建的基因缺失株的菌株制成抗原,經(jīng)滅活后制成油乳劑疫苗免
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