2015年--生物工程外文翻譯--一種能抑制蛋白合成的新型多級抗瘧劑（譯文）

1、<p><b>　　中文5030字</b></p><p>　　出處：Beatriz B, Irene H, Lee M C S, et al. A novel multiple-stage antimalarial agent that inhibits protein synthesis.[J]. Nature, 2015, 522(7556).</p><

2、p>　　一種能抑制蛋白合成的新型多級抗瘧劑</p><p><b>　　摘要：</b></p><p>　　目前世界上迫切的需要一種具有廣泛的治療潛力和新型的作用模式的治療瘧疾的藥物，以擴大治療范圍，克服新興的耐藥性。我們在這篇文章里描述了DDD107498的發(fā)現(xiàn)，一種對瘧原蟲多個生命周期階段具有有效的抗瘧活性，并且有良好的藥代動力學特性和可接受的安全性的藥物。

3、DDD107498潛在的解決了多種臨床需求，包括單劑量治療、阻斷傳播和化學保護的作用。DDD107498是從對血液階段的瘧原蟲的熒幕篩選而來，其分子的作用對象已經確定為瘧原蟲的翻譯延伸因子2（eEF2），這是負責使信使RNA的核糖體上有GTP依賴的點位的基因，是蛋白質合成的關鍵。這一對于eEF2作為藥物作用對象的發(fā)現(xiàn)為新型抗瘧藥物的開發(fā)開辟了新的可能性。</p><p>　　據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，在2013年有將近

4、2億瘧疾臨床病例與584000人死于瘧疾，這其中主要是撒哈拉沙漠以南的非洲兒童與孕婦。瘧原蟲已經進化出了對許多藥品的抗藥性，包括對于目前最主要的聯(lián)合療法的核心——青蒿素的抗藥性。為了支持目前的治療手段與根除瘧疾的議程，現(xiàn)在對于新型抗瘧劑有以下要求：新型抗瘧劑對于目前使用的藥物沒有交叉抗藥性；單劑量治療；藥物活性既針對無性血液傳播導致的瘧疾，也針對配子體傳播導致的瘧疾；藥物含有預防瘧疾的化合物（化學保護劑）；藥物含有能把間日瘧原蟲從肝臟中

5、清除的化合物（抗復發(fā)藥物）。</p><p><b>　　新型抗瘧藥的發(fā)現(xiàn)</b></p><p>　　一個鄧迪蛋白激酶分子庫（包括4731種化合物）中的表型蛋白可用來對抗3D7品種的一種多藥物敏感的瘧原蟲。從這個分子庫中取到的一種分子式為2,6-代喹啉-4-甲酰胺的化合物可以抵抗這種瘧原蟲，但是該分子的理化性質卻很差。我們通過化學優(yōu)化，使DDD107498改進了理化

6、性質并且藥效提高了100倍。該化學優(yōu)化涉及的關鍵步驟是用氟原子取代溴來減少分子質量和親油性，用乙基-吡咯烷基取代3-吡啶基，和在亞甲基間隔中加入嗎啉基。初步估計該藥物的價格與病人的使用劑量，結果表明該藥物價格低廉（每次使用約1美元）。這一點非常重要，因為多數(shù)患瘧疾的病人都非常貧困。</p><p><b>　　血液期活性和顯影性</b></p><p>　　DDD10

7、7498表現(xiàn)出對3D7瘧原蟲優(yōu)異的活性：50%有效抑制濃度（(EC50）=1.0 nM (95% 置信區(qū)間(CI) 0.8–1.2 nM)；EC90 = 2.4 nM (95% CI 2.0–2.9 nM)；EC99 = 5.9 nM (95% CI 4.5–7.6 nM)，(n=39)。它同時也對幾種耐藥菌株表現(xiàn)出同樣活躍的抑制。此外，DDD107498比青蒿琥酯在針對從巴布亞南部、印度尼西亞等高耐藥性瘧疾流行地區(qū)收集的惡性瘧原蟲和間

8、日瘧原蟲臨床病例的體外測定是更為有效的。與此相反的是，該化合物在高濃度時對人類細胞（MRC5和Hep-G2細胞）是無毒性的。</p><p>　　DDD107498表現(xiàn)出良好的類藥性質：可以從幾種生物體的肝細胞或肝微粒中穩(wěn)定的代謝出來；在不同介質的一定范圍內的良好的溶解性；極低的蛋白結合性。DDD107498在臨床前的生物實驗中表現(xiàn)出了優(yōu)秀的藥代動力學特性，包括良好的口服生物利用度（在經濟貧困的環(huán)境中使用的重要前

9、提）和長血漿半衰期（重要的單劑量治療因素和藥品的化學保護）。</p><p>　　DDD107498在幾個瘧疾小鼠模型中表現(xiàn)活躍，比目前的抗瘧藥有更大的藥效。DDD107498在對伯氏瘧原蟲感染小鼠的單劑量口服的實驗后的瘧原蟲血癥中有90%的減少（0.57mg/kg（體重））。該化合物的藥效也在移植了人類紅細胞（NOD-scid IL-2R_null）并且感染了惡性瘧原蟲的小鼠身上得到了測試。當口服給藥四天后，E

10、D90在感染后的第7天為0.95mg/kg。從感染SCID（重癥聯(lián)合免疫缺陷）的小鼠的血液采樣中表明在無性血液期感染瘧疾時DDD107498殺死瘧原蟲的最低濃度為10-13ng/ml。</p><p>　　DDD107498在循環(huán)瘧原蟲SCID小鼠模型的效果可以在一個復制周期（48小時）觀察，并且該藥效會導致滋養(yǎng)體冷凝細胞質。使用同步培養(yǎng)期特異性的研究表明：24小時內，在4nM濃度下，DDD107498是從成環(huán)期

11、形成異常滋養(yǎng)體；從滋養(yǎng)體期，DDD107498預防裂殖體形成并使瘧原蟲減少50%，表現(xiàn)了cidal的活性；從裂殖體期，阻止了環(huán)的形成使瘧原蟲減少了98%。</p><p>　　DDD107498展示的在體外與體內殺死瘧原蟲的剖面的作用是支持了疾病的普通細胞模型和動物模型。用瘧原蟲減少率在滯后的大約24-48小時檢驗，發(fā)現(xiàn)在此期間該化合物在洗出后的效果是可逆的?？焖贇绡懺x發(fā)生于瘧原蟲暴露在DDD107498中超

12、過48小時。</p><p>　　所有這些實驗都表明在血液期DDD107498發(fā)揮治療作用是在阻止滋養(yǎng)體和裂殖體形成，至少是阻止了裂殖體形成時發(fā)生了快速殺死瘧原蟲的功效。任何環(huán)形期的瘧原蟲僅僅產生了異常滋養(yǎng)體，在藥物的壓力下約48小時后就死亡。</p><p>　　在安全性研究中，DDD107498表現(xiàn)了對任何主要的人類細胞色素P450（CYP）都沒有臨床相關抑制，對CYP450的感應風險

13、很低，對臨床的藥物-藥物相互作用的風險也較低。DDD107498不會導致基因突變，并且對IKr（hERG）和其他離子通道有非常弱的抑制能力，對心血管活性有非常低的有害風險。鑒于其藥效、在臨床前生物實驗上的長半衰期、大鼠7日毒理學研究的安全系數(shù)，DDD107498有潛力成為單劑量治療和每周一次化學保護的良藥。</p><p>　　針對其他生命周期階段的活性</p><p>　　內肝細胞寄生蟲

14、（肝裂殖體期）是人類在被按蚊注入孢子被感染后的第一個階段。該化合物對于此時期的活性可以使它用于化學保護的潛力。DDD107498表現(xiàn)出了50%有效抑制濃度<1 nM時抵抗了肝臟中的裂殖體形成伯氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲。DDD107498是在初次感染（肝細胞侵入期）口服藥物后僅僅2小時就發(fā)揮了效用。與此相反，阿托伐醌（臨床上與氯胍組合用于化學保護）在這個時期的活性卻大大降低了。此外，在初次感染后的肝裂殖體期，DDD107498對于伯氏瘧

15、原蟲表現(xiàn)出了同樣的功效。這表明間歇治療對于藥物可能有足夠的保護作用。為了評估在體內的化學保護潛力，小鼠在被熒光素酶表達的伯氏瘧原蟲孢子感染之前用DDD107498治療。使用3mg/kg的劑量后，DDD107498完全治愈了小鼠并且30天后無任何寄生蟲跡象。因此，DDD107498在體內和體外模型中都有強效的化學保護作用，從實驗中的小鼠身上采集的血液表明它的最低殺滅寄生蟲的濃度在15-20ng/ml。</p><p&g

16、t;　　寄生蟲的紅細胞分化進入人宿主內無癥狀的雌雄配子體（階段I-V）。成熟期（階段V）的配子體可以感染蚊子，但是不能被當前大多數(shù)抗瘧劑消除，并且能在人體血液循環(huán)中生存長達3周，在瘧疾的臨床癥狀消失后還存在。它被蚊子攝入后，配子體開始分化出配子。DDD107498能夠有效地在雌雄配子開始形成到分化配子時期，濃度分別為1.8 nM(95% CI 1.6–2.1 nM)和1.2 nM(95% CI 0.8–1.6 nM)時抑制它。這表明它對

17、于寄生蟲的雌雄成熟配子體的功能和活性是一種非常有效的抑制劑。同時，DDD107498阻止細胞間物質傳輸，這通過標準膜運輸檢測來決定。在該測定中，給蚊子喂食前，將包括惡性瘧原蟲處于V期的配子體暴露于該化合物24小時。DDD107498在EC50的1.8nM濃度下阻止了蚊子體內瘧原蟲卵囊的發(fā)育（7天后測定）。通過感染的蚊子的數(shù)量來衡量，在DMSO控制下以每只蚊子中有27個瘧原蟲卵囊作為基準線，感染的發(fā)生率在EC50的3.7nM濃度被抑制。重

18、復在標準膜饋送測定中加入在EC50的10nM濃度的DDD107498，說明該化合物對蚊子腸道中的瘧原蟲有有效的抑制性。</p><p>　　伯氏瘧原蟲小鼠-小鼠模型還用于檢測細胞運輸?shù)姆怄i。小鼠感染伯氏瘧原蟲，然后在被蚊子叮咬前24小時口服該化合物以3mg/kg的劑量后，觀察10天，與未經處理的小鼠相比蚊子減少了90.7%，腸中的卵囊減少了98.8%。在子孢子和普通細胞的中觀察到了對比（分別為93.8%和88.6

19、%）。蚊子先使它們受感染，未感染的小鼠以受過藥物治療的小鼠喂養(yǎng)。測試蚊子的叮咬率，我們觀察到瘧疾發(fā)展到血液階段的小鼠比被無藥物治療過的感染小鼠所喂養(yǎng)的小鼠的數(shù)量平均減少89.5%（95%置信區(qū)間71.4-100）。在這個環(huán)形傳播（小鼠——蚊子——小鼠）的整體效果可以通過估計它的基礎生殖減少的數(shù)目來量化確定。這被稱為“影響大小”的干預。通過從擬合小鼠—小鼠二項鏈式模型的數(shù)據(jù)我們可以評估干預效果的大小，評估使用DDD107498減少蚊子基礎

20、生殖的數(shù)量。我們根據(jù)結果估計的影響大小為90.5%（95%CI 78.3-94.2），這表明DDD107498能夠作為一種有效阻斷瘧疾多重傳播的藥物。這些關鍵的體外和體內實驗組合表明了DDD107498對于阻斷瘧疾傳播有很強的潛力；更重要的是，所需的劑量可能是類似于治療血液期瘧疾的劑</p><p>　　DDD107498攻擊PfeEF2基因</p><p>　　為了確定DDD107498

21、攻擊的分子目標，使無性血液期的瘧原蟲在存在DDD107498的培養(yǎng)液中培養(yǎng)直到瘧原蟲出現(xiàn)耐藥性。在3D7（藥敏性）、7G8和Dd2（耐多藥性）中獲得耐藥性的寄生蟲，各自剩下的數(shù)量分別是107、107和106個。從有抗藥性的寄生蟲中提取的基因組和十個耐藥基因的全基因組測序，確定了他們中的一個共有的并且在親本中不存在的突變：Pf3D7_1451100。該基因編碼惡性瘧原蟲的翻譯延伸因子2（PfeEF2）。PfeEF2中的三條鏈有2個單獨的多

22、態(tài)核苷酸，在每一個位置都有一個混合野生型突變，這表明這些鏈混合了PfeEF2獨立突變的兩個復制體。PfeEF2聚合在3個編碼蛋白上的單多態(tài)核苷酸和9個突變可以用Sanger測序驗證。在兩條鏈上的兩例相同的單核苷酸多態(tài)性被確定的情況，表明在功能上重要的殘基可在獨立的選擇實驗中獲得突變。事實上，抗DDD107498的基因可以與多個獨立的突變相關聯(lián)，這與青蒿素及其他抗瘧藥的發(fā)展是一樣的。</p><p>　　eEF2是

23、真核細胞合成蛋白質所必須的，通過調節(jié)GTP依賴的核糖體的轉運以及信使RNA的幾個基本延伸因子之一。酵母eEF2是抗真菌化合物的糞殼菌素的作用對象。糞殼菌素在體外對于麥酒酵母菌的eEF2的選擇性大于對人類eEF2基因，這表明盡管真核細胞的蛋白合成是受保護的，但是仍然可能被抑制劑選擇性抑制，即使人類和酵母菌的eEF2相似性極高（67.2%相同）。保持選擇性的潛力同時，DDD107498對于人類細胞無毒性。PfeEF2突變與抗性相關映射到多個

24、領域的同源模型表面的蛋白質的結構的基礎上(無配體結合的釀酒酵母eEF2結構的基礎),與突變阻力集中程度最高。一個DDD107498結合帶不能被這些模擬研究所闡釋。</p><p>　　我們證明，簡單的使惡性瘧原蟲與DDD107498生長可以使其蛋白合成被抑制，通過測量前加入[35S]標記的蛋氨酸和半胱氨酸以及惡性瘧原蟲抗DDD107498的3D7蛋白。環(huán)己酰亞胺（一種蛋白質合成抑制劑）和DDD107498都能阻止

25、蛋氨酸/半胱氨酸進入惡性瘧原蟲3D7，而放線菌素D（RNA轉錄抑制劑）影響很小。值得注意的是，DDD107498抑制蛋白合成的效率是WT寄生蟲抗DDD107498的3D7的效率的100倍，環(huán)己酰亞胺同樣在阻止蛋氨酸/半胱氨酸組裝到WT鏈上。DDD107498和環(huán)己酰亞胺特異性的對敏感性和抗藥性的寄生蟲的生物合成DNA/RNA的影響最小（以[H3]標記的次黃嘌呤）。相反，放線菌素D引起的反應明顯依賴于[3H]劑量減少。</p>

26、<p>　　為了確定PfeEF2是DDD107498的作用對象，我們整合了可以表達WT PfeEF2或者PfeEF2抗性相關的等位基因（Y186N觀察突變Dd2；P754S觀察突變3D7）的轉基因，使用attPxattB整合酶介導的重組。這些內含子也表達PfeEF2。綠色熒光蛋白（GFP）-融合成像PfeEF2顯示的胞質定位，這表明DDD107498抑制蛋白質在細胞質中合成頂質體中四環(huán)素和阿奇霉素的位點的行動。劑量反應試驗

27、表明DDD107498 PfeEF2轉基因表達線和WT DD2應變之間存在類似的抑制曲線，表明內源性WT PfeEF2實驗中具有主導作用。這可能是由于形成穩(wěn)定的復合物之間的核糖體，WT PfeEF2和DDD107498，導致核糖體失速，這可以解釋為什么WT PfeEF2是占主導地位的混合品種。例如，細菌，夫西地酸在EF-G和核糖體之間的復雜結合、抑制解離、抑制蛋白質的翻譯。</p><p>　　為了確定WT Pf

28、eEF2是否會對翻譯有不良影響，我們引入了游離質粒編碼的WT或Y186N突變的PfeEF2到耐受PfeEF2、Y186N的鏈上。載PfeEF2-Y186N的質粒對DDD107498沒有影響，同時WT PfeEF2恢復了靈敏度。這表明重量WT PfeEF2寄生蟲的易感性的顯性效應和證實PfeEF2是DDD107498的主要作用對象。我們注意到淺坡觀察WT PfeEF2轉錄鏈很可能是由于異構游離質粒拷貝數(shù)與游離的寄生蟲轉錄鏈作用的結果。結構

29、的研究需要準確定義DDD107498如何與eEF2和核糖體的相互作用。</p><p>　　瘧疾的抗藥性已經波及了所有的臨床抗瘧藥，包括青蒿素。而相關抗性之間的關系在實驗室和臨床設置抗瘧藥中尚不能完全理解,在是在臨床前和臨床研究中對所有新抗瘧藥很重要的風險評估。在我們的研究中，產生抗DDD107498的最小接種物在可接受的范圍內。此外，被選擇的耐藥Dd2鏈顯示受損的增長率在藥物壓力下與WT Dd2相比較，耐藥性越

30、大，健康的缺陷越大。重要的是，從17個國家1685株臨床分離的惡性瘧原蟲的基因組序列顯示PfeEF2的高度序列保守性。唯一的非同源單核苷酸多態(tài)性（T16S）確定對于西非是特異性的（0.002等位基因頻率）并且在PfeEF2里與體外抗DDD107498是不同的突變。</p><p><b>　　結論</b></p><p>　　DDD107498代表了抗瘧藥的發(fā)展前景，

31、對瘧原蟲的多個生命周期階段具有強效活性，是一種新的作用模式和有優(yōu)良的抗藥性。它具有單劑量治療的潛力，這對確保患者的依從性和實際治療有重要意義。其對寄生蟲的有性階段互補活動有可能降低疾病傳播及其在肝階段行動表明它有化學保護作用?；瘜W保護作用和阻斷疾病傳播的特性是消除和消滅瘧疾的基礎，而高效力的DDD107498半衰期長，很適合這種疾病。</p><p>　　由于瘧疾抗藥性的出現(xiàn)成為一種普遍的問題，所有的抗瘧藥的開發(fā)

32、形成聯(lián)合治療，是一種能夠提高療效和減少耐藥性的發(fā)展策略。在紅細胞期的治療，DDD107498能夠長期的作為一種藥物完成血液階段的寄生蟲清除。因此，DDD107498應該結合快速作用的化合物，最好具有藥理作用持續(xù)時間盡可能接近DDD107498的特性。這樣可以減少感染的初級階段，剩下的時間就依靠DDD107498消除剩余的寄生蟲。</p><p>　　DDD107498通過抑制PfeEF2的蛋白質合成在多個生命周期