生物工程外文翻譯--粉螨中腸ph的測定（譯文）

1、<p>　　Determination of pH in regions of the midguts of acaridid mites</p><p><b>　　粉螨中腸pH的測定</b></p><p><b>　　摘要：</b></p><p>　　螨類中腸的pH值強(qiáng)烈影響著他們的消化過程。這個研究確

2、定了12種倉儲螨的房屋塵螨的中腸pH值。在螨類喂食試驗中選用了18種指示劑。基于指示劑的顏色變化，螨類的中腸內(nèi)容物pH值范圍確定為4-7之間。中腸內(nèi)部pH從前部到后部呈現(xiàn)梯度變化。大部分物種的中腸前部（前胃和盲腸）pH變化4.5-5之間，有些物種呈現(xiàn)弱堿性,而中腸中部（中部結(jié)腸）pH5-6。中腸后部（后結(jié)腸）的pH在5.5-7之間。在測試螨類中除了粉塵螨外其他螨中腸pH沒有顯著地差異。塵螨的中腸酸性更強(qiáng)，前部（pH4-5），結(jié)腸（pH5

3、)后部結(jié)腸（pH低于6）。在螨中腸的體內(nèi)條件獲得的結(jié)果為螨消化酶活性包括他們的抑制劑和中腸微生物群落的研究提供了有力的幫助。</p><p><b>　　前言</b></p><p>　　生態(tài)上的螨是重要的害蟲，他們的中腸的pH值會很大程度影響殺螨作用、病原體感染的成功率、消化過程。研究害蟲消化酶活性劑中腸微生物群叢的首先必須是鑒定中腸pH值(Skibbe et al

4、. 1996; Terra et al. 1996; Funke et al. 2008)。雖然已有部分確定中腸pH值的研究，但是確定生態(tài)螨的消化范圍的pH值的研究還很少。</p><p>　　基本上，比色法、電位測定法、和電導(dǎo)分析法是常用的確定pH值得方法(Carsky 1981)。微電極是昆蟲中確定pH最常用的工具(Brune et al. 1995; Harrison 2001; Zimmer and Br

5、une 2005; Gross et al. 2008),但由于螨蟲體型極小無法使用。Skibbe et al. (1996)提出核磁共振成像作為確定昆蟲中腸pH的可選用的方法，而此方法不常用。</p><p>　　pH比色法利用加酸顯色化學(xué)試劑作為指示劑。酸堿指示劑顏色根據(jù)pH的改變而改變成是由奧斯瓦爾德提出的理論，后由漢奇提出互變異構(gòu)的概念：人類的眼睛能夠預(yù)計的顏色變化的濃度比率是10:1-1:10，改變范圍

6、約是pH=~pKA(HIn) ± 1，pKA(HIn)是指示劑的解離常數(shù)。根據(jù)奧斯瓦爾德理論，pH指示劑是弱酸或者弱堿，pH接近值是滴定指數(shù)pT。顏色的改變時由于H離子的激活導(dǎo)致指示劑的解離和非解離形式。指示劑在特定pH值下不會急劇的改變，但會在一個小范圍的pH值內(nèi)改變。指示劑在這個范圍內(nèi)的某個pH值顯示中間體的顏色。(Brdicka and Dvorak 1977; Dvorak and Koryta 1983; Holzb

7、echer and Churacek 1987).</p><p>　　雖然利用pH指示劑獲得結(jié)果與電勢測定的結(jié)果一致(Espinoza-Fuentes and Terra 1987; Boudko et al. 2001)，但是電勢測定的結(jié)果比指示劑方法更精確。由于螨類體型極小，測定消化道范圍pH唯一可用的方法是指示劑法。由于螨類身體極小且透明可使用染色法并利用化學(xué)染色劑直接測定定中腸的pH值。這個方法曾用幾個

8、pH指示劑如石蕊、酚紅、通用指示劑、中性紅確定中腸的生理pH(Hughes 1950; Akimov and Barabanova 1976, 1978; Akimov 1985)。這是利用18種指示劑基于染色法首次對倉儲螨及塵螨中腸pH的研究。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p>　　測試的12種螨，包括5種粉螨（粗足粉螨、橢圓板白螨、S

9、ancassania rodionovi Zachvatkin、(syn. Caloglyphus redickorzevi Zachvatkinand Caloglyphus hughesi Samsinak)、腐食酪螨、線嗜酪螨、）；果螨（甜果螨）、嗜渣螨（拱殖嗜渣螨）；塵螨（粉塵螨、戶塵螨）；食甜螨科（家食甜螨，和Aëroglyphus robustus）。這些螨類在捷克布拉格水稻研究學(xué)會實驗室飼養(yǎng)（詳細(xì)的飼養(yǎng)條件見

10、Erban和Hubert，2008）。</p><p>　　指示劑的應(yīng)用和螨類顯微鏡觀察的制備</p><p>　　指示劑的選擇是基于他們的pT和/或pKA值及變色范圍(Holzbecher and Churacek 1987, Senese 2000, Shevchenko and Kulichenko 2005, Sabnis 2008)。所有的指示劑都購于Sigma-Aldrich。

11、所有的指示劑分為6組：（1）確定pH3-8的指示劑：酚酞(p KA = 9.1, 9.4, 9.53, 9.70; pT = 8.4-9.4; transition range = 8.3-10.0)、百里酚藍(lán)(pKA= 1.65; 8.90; pT = 2.6 and 8.4; transition range = 1.2-2.8 and 8.0-9.2)（2）確定pH制接近7的指示劑：石蕊(pKA= 7.00; pT = NF (n

12、ot found); transition range = 5.0-8.0)、苯酚紅(p KA = 7.9; pT = 7.0; transition range = 6.8-8.2)、亮黃 (p KA = NF; pT = NF; transition range = 6.5-8.</p><p>　　將指示劑溶解在水或水-乙醇溶液中，混入小麥中獲得終濃度2%（wt/wt）的指示劑。利用振蕩器混勻濕的富含指示劑

13、的飼料，然后置于密封的玻璃管中凍干 (Heto PowerDry LL3000, Thermo Fisher Scientific, www.thermo.com)。每個1.5ml離心管中放入約5mg粉末,加入至少50個樣本。每個管中加入一張濕濾紙。間隔24,48,72小時螨被轉(zhuǎn)移到玻璃有蓋培養(yǎng)皿。在螨分散后，在解剖顯微鏡下用毛筆收集攝取指示劑的樣本。在用光學(xué)顯微鏡觀察前用生理鹽水（0.9%Nacl）洗滌螨外部的飼料碎渣。</p&

14、gt;<p><b>　　螨中腸的顯微觀察</b></p><p>　　在Axioskop復(fù)合顯微鏡利用Axiovison軟件和powershotA620數(shù)碼相機(jī)下觀察中腸顏色的變化。每個最小的方案每個物種每種指示劑包括10個陽性觀察。不同于組織學(xué)研究，中結(jié)腸不能夠在觀察中被識別出來。此研究中，除了中結(jié)腸外，確定了前胃、盲腸、結(jié)腸和后結(jié)腸的顏色變化（纖細(xì)的腸道解剖圖，見圖1）。

15、染料顏色的在腸道內(nèi)腔的變化進(jìn)行考慮，省略食物和糞便沸騰物（獲得高濃度指示劑）。為了產(chǎn)生顏色對照，顏色指示劑溶解于Britton Robinson緩沖液I。這個過程精細(xì)到0.1pH單位，顏色的改變與顯微鏡觀察的顏色的改變進(jìn)行比較。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　未喂食指示劑食物的螨類的身體是透明的。攝取指示劑的螨中腸顏色改變。（表1）&l

16、t;/p><p>　　確定pH3-8之間的指示劑</p><p>　　酚酞始終是無色的，與沒有指示劑的觀察結(jié)果一樣。百里酚藍(lán)始終是黃色的，沒有例外的。</p><p>　　確定pH值接近7的指示劑</p><p>　　除了紅色石蕊和苯酚紅染色的紅色后結(jié)腸外，在所有案例中指示劑顯示出黃色。顏色變化證實中腸的pH大部分低于6.5。在所以物種試驗中苯酚

17、紅在后結(jié)腸的染色具有種間不同。證明在一些螨類中后結(jié)腸的pH約7。</p><p>　　確定中腸PH堿性限制的指示劑</p><p>　　這組指示劑的pH范圍的上限是6.0。中文指示劑的共同顯示了所有測試螨類的盲腸和前胃PH低于6。在結(jié)腸和后結(jié)腸，被觀察到為紅色，從結(jié)腸到后結(jié)腸紅色顯著增加。只有塵螨和A.robustus顯示整個顏色都是黃色。</p><p>　　確定

18、中腸酸限的指示劑</p><p>　　基本上，指示劑顏色的改變證實在mesodeal腔的pH高于4。盲腸、前胃、結(jié)腸被溴苯酚藍(lán)染成藍(lán)色。然而，在表皮塵螨屬中兩種螨中不同，被染成黃色和綠色。在樣本T. lini 中，在前胃和盲腸中被染成綠/藍(lán)色。甲基橙和剛果紅（圖2A）在所有測試物種中的所有mesodeal隔室中產(chǎn)生相同的顏色。在整個中腸中甲基紅產(chǎn)生黃色，剛果紅產(chǎn)生紅色。茜素紅S產(chǎn)生紅或者黃色染色的中腸，與其他染色

19、劑不一致。</p><p>　　在酸或堿限制內(nèi)確定pH更為精確的指示劑</p><p>　　甲基紅為紅色時證實pH低于5，為黃色時pH高于5. 甲基紅為紅色時證實pH低于5，為黃色時pH高于5.被甲基紅染成紅色的盲腸的胃被證實pH低于5。另一方面，結(jié)腸為黃色，說明pH高于5。黃色的后結(jié)腸證明pH高于6。這是基于甲基紅的變色范圍（4.4-6.2）且PH低于6.2時不會出現(xiàn)黃色的基礎(chǔ)上。甲基紅

20、很好的說明了整個中腸從中間酸性盲腸、前胃到中性的后結(jié)腸的pH梯度。在這些范圍內(nèi)，刃天青的顏色從橙色到紫羅蘭變化?；谧兩?，紫紅色能夠在大約pH5及更堿一點的時候被觀察到，而紫羅蘭大約在pH5.5或者更堿一點被觀察到。在中腸中大部分的顏色為橙色。在這些物種中在結(jié)腸呈紫紅色，后結(jié)腸呈紫羅蘭的情況很少見。溴苯酚綠在pH范圍4.2-4.7之間呈綠色，在4.8-5之間呈藍(lán)綠色。pH低于4.2呈現(xiàn)黃色。在pH5.1-7之間呈藍(lán)色，大部分物種的前胃和

21、盲腸呈藍(lán)色或綠色。除了四種螨的前胃和盲腸呈現(xiàn)黃色，粗足粉螨、拱殖嗜渣螨是黃色混著藍(lán)色，一些塵螨的樣本前腸大部分為黃色。總體而言，結(jié)腸和后結(jié)腸的藍(lán)色在物種見沒有太大差異。在某些樣本中結(jié)腸的一些綠色染色更進(jìn)一步證實結(jié)腸比后結(jié)腸酸性更強(qiáng)而比前胃和盲腸堿性更強(qiáng)。</p><p><b>　　通用酸堿指示劑</b></p><p>　　這組指示劑代表了能夠確定（有些局限性）pH

22、的混合物，精確度是1個pH單位。UABI3-10在前胃和盲腸中顯示亮橙色，說明pH在4和5之間。在結(jié)腸和后結(jié)腸中亮橙色變?yōu)辄S色說明pH在6+-0.5。而結(jié)腸和后結(jié)腸若呈綠色則說明更堿。此外在mesodeal細(xì)胞和卵巢中綠色染色說明PH約為7。UABI0-5在整個中腸的產(chǎn)生的顏色一般都是藍(lán)/藍(lán)綠或者藍(lán)色，證實所有的隔室的pH高于4。UABI4-10在前胃和盲腸中呈現(xiàn)橙色而在結(jié)腸和后結(jié)腸中為黃色，說明在前胃和盲腸中pH低于5，結(jié)腸和后結(jié)腸p

23、H在5和6.5之間，在mesodeal細(xì)胞和卵巢中呈綠色，pH約為7。UABI3-10的結(jié)果也一樣（圖2B）。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　利用酸堿指示劑確定pH可作為測定節(jié)肢動物中腸pH的通用方法，前提是節(jié)肢動物的身體是透明的或者可以獲得解剖的中腸(Terra and Regel 1995)。當(dāng)樣本的身體太小而無法使用微電極時，酸堿

24、指示劑可適用，雖然微電極測量更精確。酸堿指示劑的不足之處是，測定主要來自于主觀的判斷，因為PH指示劑容易受不精確地閱讀影響。因為指示劑在一個特定的pH值內(nèi)不會大幅度的改變顏色。為了利用指示劑精確的測定pH值,需要使用很多指示劑。每個pH指示劑都有一個變色范圍表，但是不能精確的確定pH。顏色包含的變色范圍中從低pH下限到高pH上限，但人類的眼睛無法直接分辨出兩種在接近滴定指數(shù)（pT）的點上顏色。pT能夠幫助我們評估數(shù)據(jù)，但是需要注意的是它

25、有一些限制。下面是使用這么多顏色的pH指示劑測定中腸隔室pH的一些主要原因。</p><p>　　利用通用酸堿指示劑確定最初的pH,能夠預(yù)先篩選中腸中大概的pH,可以減少指示劑使用的數(shù)量。在本實驗中，他能排除的只有酚酞和百里酚藍(lán)的使用。如果進(jìn)行預(yù)先篩選主觀的決策可能會影響實驗結(jié)果(Barrow and Conrad 2006)。用于獲得目的數(shù)據(jù)至少需要幾個而不是1個兩個指示劑，因為每個指示劑能確定的pH值精確度是

26、+-1。在考慮和評估數(shù)據(jù)時要遵循Ostwald 和 Hantzsch 的物理化學(xué)理論。例如，近似平均值在變色范圍內(nèi)并不準(zhǔn)確。</p><p>　　螨類中腸pH初步研究顯示粗足粉螨的前胃和盲腸在5.0-6.0之間，而結(jié)腸pH在7.0-8.0之間(Hughes 1950).最近，16種螨的中腸的pH測定，確定盲腸和前胃5.4-6.3之間，結(jié)腸5.9-7.4，后結(jié)腸在6.8-8.0 (Akimov and Baraba

27、nova 1976, 1978; Akimov 1985)。由于這些結(jié)果使用的指示劑 (石蕊, 苯酚紅，中興紅 )數(shù)量有限，可能存在一些不精確。此外，根據(jù)物理化學(xué)定律測定pH精確到0.1pH單位是不可能的。例如，石蕊是基本能確定酸或堿的的pH指示劑因為它在pH7時是紫色。石蕊的變色范圍很寬，從4.5-8.3之間。通過休斯能夠測定粗足粉螨結(jié)腸在變色范圍pH約6-7內(nèi)使其顯示紫色。在更酸的值，這個指示劑開始變藍(lán)，但不易觀察到。石蕊呈紫色，證

28、實pH中性，在我們的研究中后結(jié)腸食物蒸餾，在后腸部位我們提出顏色能夠被更高濃度指示劑影響。中性紅和酚紅顯示在前胃、盲腸、結(jié)腸pH低于7。只有通用指示劑能夠更精確pH,但是在通用指示劑在至少1-2單位的一個范圍內(nèi)經(jīng)常有相同的顏色。</p><p>　　然而，基于先前的研究，中腸pH的堿性限制接近或者低于8，而酸性限制不清楚。利用酚酞和百里酚藍(lán)確定pH能夠獲得相同的結(jié)果。此外，百里酚藍(lán)能夠排除強(qiáng)酸（pH低于3）。根據(jù)

29、兩組指示劑（測定接近7pH值的組指示劑和確定中腸堿性限制的指示劑）的結(jié)果，后結(jié)腸的pH堿的限制為6.5-7，結(jié)腸的堿pH限制是6。塵螨和粗足粉螨有不同的屬，在后結(jié)腸和結(jié)腸中pH都為大約6。</p><p>　　確定中腸pH酸限制的指示劑，基本上，顯示全腸的pH高于4或者接近4。茜素紅S測試結(jié)果得出的在所有隔室中黃色和紅色的存在被極寬的pH變色范圍（pH3.5-6.5）影響的結(jié)論。第二，染色被Ca離子存在影響(Da

30、hl 1952)。這兩種塵螨在盲腸和前胃在pH4存在極強(qiáng)的緩沖趨勢。利用指示劑確定pH在酸和堿限制中更精確，說明在這兩種塵螨中腸中更酸的pH。與他們飼喂富含食物資源和半胱氨酸蛋白酶的存在一致（以前的過敏原Der p1和Der f1）(Tovey et al. 1981)。用塵螨部分進(jìn)行免疫染色顯示了在胃部后部的細(xì)胞內(nèi)Der p1的分泌和合成(Tovey and Baldo 1990)。在昆蟲中，半胱氨酸蛋白酶的最適酸性pH是有記錄的在

31、螨中是可以預(yù)期的。</p><p>　　如下所示，指示劑在酸和堿限制中測定pH更精確，使螨類中腸的形態(tài)學(xué)隔室能夠更準(zhǔn)確測定pH，包括（a)前腸（前胃和盲腸），pH范圍4-5；（b)中腸（內(nèi)結(jié)腸/結(jié)腸），pH5-6之間；（c)后結(jié)腸，pH范圍5.5-7。此外，利用指示劑紅/黃甲基紅和藍(lán)/綠溴甲酚綠，螨（除了塵螨）前胃和盲腸的pH在4.5-5之間或者微堿測定更精確。塵螨的前腸（pH4-5）、結(jié)腸(pH5)、后結(jié)腸（p

32、H低于6）的酸性更強(qiáng)。</p><p>　　在許多物種間中腸內(nèi)腔的pH具有主動調(diào)整性并隨著系統(tǒng)發(fā)生級攝食生態(tài)學(xué)變化(Harrison 2001)。　他腸道理化性質(zhì)通過優(yōu)化來利用食物來源(Zimmer and Brune 2005)。在mesodeal的pH和在腔內(nèi)水解營養(yǎng)物的消化酶的最適條件之間具有一定的關(guān)系(Terra et al. 1996; Funke 2008)。腸道pH值不僅對消化酶是重要的,它也會影響

33、食品成分溶解度,攝入蛋白質(zhì)的離解或凝固,腸道微生物區(qū)系的存在 (Funke et al. 2008)。螨類中已知一些螨的酶最適pH，進(jìn)一步觀察腸道的pH。溶菌酶的最適條件的pH值是4.0 -5.0，對應(yīng)的腔內(nèi)的pH值實在胃和盲腸,胃和盲腸局部存在溶菌酶活性。糖苷酶的最適pH是5-6(Akimov and Barabanova 1976a, 1976b, 1978; Akimov 1985; Sanchez-Mongeet al. 199

34、6; Hubert et al. 2005; Hubert et al. 2007)。然而,對于纖維素酶(5 - 7.5)和幾丁質(zhì)酶（5 - 8)最適 pH值范圍在許多物種測試中與腸道腔室</p><p>　　由于螨類是重要的過敏原，他們的蛋白酶被廣泛研究(Tovey et al. 1981)。酶分析通?；谔禺愋院头翘禺愋缘孜锱c抑制劑平行物的結(jié)合(Ortego et al. 2000, Monteallegre

35、 et al. 2002, Sanchez-Ramoz et al. 2004)。在體外，酶活通常在堿性條件下測定。例如，螨蛋白酶利用測定偶氮酪蛋白作為非特性底物，說明身體萃取物的最適pH是6.0，排泄物最適pH為9.5-10.0?！⊙t蛋白蛋白質(zhì)水解的的最適pH值在pH 3或4證實非消化酸蛋白酶的存在。在兩個螨蟲身體和排泄物的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶特異活動的最適pH值的近7~10.5。 Monteallegre等測定了pH7.8和7.