柳蠶絲心蛋白重鏈N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蠶絲是自然界最引人矚目的生物材料之一，分為家蠶絲和野蠶絲兩大類。家蠶絲廣泛應(yīng)用于紡織品和手術(shù)縫合線。近些年來(lái)，野蠶絲在生物材料方面的應(yīng)用已成為一個(gè)新趨勢(shì)。蠶絲蛋白制備的不同材料具有生物相容性、可控降解性和突出的機(jī)械性能三大特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物輸送、組織工程支架、體外疾病模型、填埋劑等。蠶絲是以絲心蛋白為中心，包被多層絲膠蛋白的復(fù)合纖維。重鏈(Fibroin heavy chain，F(xiàn)ibH)含有重復(fù)晶形區(qū)以及非重復(fù)的N末端區(qū)和C末端區(qū)

2、。FibH作為絲心蛋白的核心蛋白，構(gòu)成了蠶絲的骨架，決定著蠶絲的主要理化性質(zhì)，因此從分子層面上研究它的組裝機(jī)理和調(diào)控機(jī)制是非常具有價(jià)值的。家蠶的絲心蛋白由重鏈(390 kDa)、輕鏈(26 kDa)和糖蛋白P25(30 kDa)以6∶6∶1比例形成大的復(fù)合物，而研究表明，大蠶蛾科下的野蠶絲心蛋白不含有輕鏈和糖蛋白，卻是重鏈以共價(jià)鍵相連的二聚體復(fù)合物形式存在。我們課題組解析了家蠶重鏈N末端結(jié)構(gòu)域(BmFibNT)的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，BmFibN

3、T以同源二聚體結(jié)構(gòu)存在，由兩個(gè)單體交叉形成8股反平行的β-sheets，每個(gè)單體含有四股β-sheet，兩兩成對(duì)形成β-hairpins結(jié)構(gòu)。然而柳蠶絲的裝配過(guò)程中重鏈N末端結(jié)構(gòu)域(AsFibHN)發(fā)揮著怎樣不同的功能，正是本文力求攻克的難題。
　　本研究中，我們通過(guò)分子篩、SDS-PAGE、DLS、Westernblot、NMR(1H-1HNOSEY)等手段鑒定得知柳蠶絲心蛋白重鏈N端結(jié)構(gòu)域(AsFibHN)在溶液中始終以單聚體

4、形式存在，而B(niǎo)mFibHN卻是以穩(wěn)定二聚體形式存在，二聚體間存在的強(qiáng)疏水相互作用難以被SDS、尿素和高溫破壞掉。通過(guò)圓二色譜和核磁滴定實(shí)驗(yàn)鑒定AsFibHN二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量隨著pH值和乙醇濃度的變化發(fā)生了改變。最后利用核磁學(xué)手段對(duì)AsFibHN(19-105)蛋白采集了1H-15N HSQC、CBCANH、CBCA(CO)NH、HNCO、HN(CA) CO、HBHA(CBCACO)NH、 H(CCO)NH-TOCSY、(H)CC(CO)N

5、H-TOCSY、15N-NOESY、13C-NOESY、HCCH-COSY和HCCH-TOCSY等一系列三維譜圖，基于CBCANH和CBCA(CO)NH三共振譜圖，除開(kāi)末端柔性較大個(gè)別氨基酸和脯氨酸外，指認(rèn)完成度較高，96.9％主鏈和81.4％側(cè)鏈均被成功指認(rèn);基于CA、CB、N、NH和HA的化學(xué)位移，利用Talos+軟件預(yù)測(cè)得到AsFibHN(19-105)能存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示大多以無(wú)規(guī)卷曲形式存在;進(jìn)而15N-NOESY和13