微生物外文翻譯（中文）--超高壓和溶解二氧化碳對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同滅活作用

1、<p><b>　　中文6560字</b></p><p>　　超高壓和溶解二氧化碳對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同滅活作用</p><p>　　王莉a,b 潘見 a 謝慧明a 楊一 a 林春明a</p><p>　　a微生物研究工程，中國教育部，中國安徽省合肥市屯溪路193號郵編2300009</p>&

2、lt;p>　　b中國安徽省合肥市屯溪路193號郵編2300009 合肥工業(yè)大學化工學院</p><p>　　文 摘：該研究主要是針對超高壓和溶解的二氧化碳對微生物的協(xié)同作用。該研究的目的是為了減少傳統(tǒng)超高壓技術的壓力以便于使得更加經(jīng)濟可行。超高壓和溶解二氧化碳處理在液體中懸浮的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，與僅僅超高壓處理在液體中懸浮的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，前者具有更強的殺菌作用。為了加強二氧化碳的影響，

3、一種新的設備被設計出來了，該設備能夠溶解，保留和測量二氧化碳的濃度。其結果顯示出在300Mpa，1.2NL/L二氧化碳和250Mpa和3.2NL/L二氧化碳處理大腸桿菌能夠使大腸桿菌降低8個對數(shù)級。然而在僅300Mpa和250Mpa處理大腸桿菌時僅降低2.2和1.8個對數(shù)級。對金黃色葡萄球菌來說，在350Mpa，3.8NL/L二氧化碳協(xié)同處理金黃色葡萄球菌將菌落數(shù)降低7個對數(shù)級以上，然而金黃色葡萄球菌將菌落數(shù)降低0.9個對數(shù)級僅在350

4、Mpa處理金黃色葡萄球菌時。標準電子顯微鏡照片表明了細菌的形貌的嚴重的變化在超高壓和溶解的二氧化碳對微生物的協(xié)同處理以后。相反，細胞僅在超高壓處理時還是相對圓滑的。在經(jīng)過超高壓處理后的細菌碘化丙碇熒光染色被觀察來確定滲透性的變化。其結果表示超高壓和溶解的二氧</p><p>　　關鍵字： 協(xié)同滅活 二氧化碳的溶解 超高壓 大腸桿菌 金黃色球菌</p><p><b&g

5、t;　　1 介紹</b></p><p>　　超高壓滅菌（HHP）能夠替代巴氏加熱滅菌，在液相和固相食品體系中來保存營養(yǎng)是最有前景的非加熱的滅菌工藝。為了提高超高壓的效率，減少操作壓力和保壓時間是很有必要的，這能夠減少工藝過程費用。除了處理的壓力，細菌的耐壓性也是一個重要的參數(shù)，這主要取決于細菌的種類和處理條件。通常來說，要求超高壓壓力超過600Mpa或者更高的壓力來達到滅活效率這已經(jīng)限制了在超高壓技

6、術方面商業(yè)上的突破。最近，為了減少滅活的壓力，不同的協(xié)同有效條件得到了更多的關注，和一些共同條件已經(jīng)被研究來優(yōu)化工藝過程和超高壓滅活機理。這些聯(lián)合的因數(shù)包括抗菌素，PH和合適的溫度?？咕貋碜杂诖笞匀?，例如尼生素，片球菌素，溶解酵素和乳過氧化物酶已經(jīng)和超高壓協(xié)同處理細菌來查看滅菌效果。這已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如溶解酵素和抗菌劑能夠有效滅活的革蘭氏陽性的細菌。由于來自外層細胞膜的保護和多肽類和酶的抵抗，抗生素對革蘭氏陰性的細菌更加不明顯，盡管超高壓在一

7、定程度能夠提高其敏感程度。 乳過氧化物酶和超高壓400Mpa一起處理大腸桿菌并不能提高滅活效果。在PH和適宜的溫度協(xié)同超高壓處理細菌，表明了非常有效的滅菌效果。這些不同的因素能夠對耐壓和對壓力敏感的食品</p><p>　　二氧化碳是另一種抑制細菌生長的化合物。和所提到細菌素和尼生素，小分子非極性的二氧化碳在超高壓下能夠滲透革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的細菌，這會導致細菌細胞膜的有效破壞。二氧化碳和超高壓協(xié)同處理不同種

8、類的細菌包括芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌的滅活機理已經(jīng)被闡明。在二氧化碳相區(qū)，超臨界或接近臨界二氧化碳被用來滅菌，這個過程和超高壓一起處理細菌在二氧化碳中。在DPCH技術中，二氧化碳氣體壓力一般在10到25Mpa和在30到50℃之間和保壓1h以上來滅菌。超高壓能夠被認為是比二氧化碳氣體壓力處理更安全和更經(jīng)濟的。然而，這一挑戰(zhàn)仍然存在在給定的二氧化碳濃度和可行的包裝的超高壓處理。因此，協(xié)同滅活效果已經(jīng)被限制在低二氧化碳濃度和超高壓處

9、理。</p><p>　　在當前工作，我們發(fā)展了一種先的方法去溶解二氧化碳和維持二氧化碳在溶液介質中。在超高壓和不同濃度的溶解二氧化碳處理細菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）在更強的滅活效果已經(jīng)被闡明。這細菌在超高壓協(xié)同二氧化碳和僅超高壓處理后的細胞形態(tài)的變化和膜滲透的變化已經(jīng)在標準電子顯微鏡下觀察，和用碘化丙碇染色來冊熒光來確定細胞膜前后滲透性的變化。這結果能夠能夠提供有效的滅活效果在溫和的超高壓壓力和更好的超高壓

10、和溶解二氧化碳的協(xié)同滅活效果！</p><p><b>　　2 材料和方法</b></p><p>　　2.1 微生物和生長條件</p><p>　　2種微生物（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）細菌被用來檢測機理。它們被接種在PH接近6.7的營養(yǎng)肉湯中或者接種在沒有在37℃攪拌16h直到達到固定相。細胞濃度一般108-109cfu/ml</p&

11、gt;<p>　　2.2 二氧化碳溶解度和超高壓處理</p><p>　　二氧化碳溶解度和超高壓處理已經(jīng)被顯示在圖一。為了溶解二氧化碳使其在特定的濃度和維持二氧化碳在營養(yǎng)肉湯在的滲透性，我們發(fā)明并且發(fā)明了耐壓瓶其容量在100ml，其外徑為35mm和0.35mm的不銹鋼壁。細菌懸浮液被轉移到耐壓瓶中為了充二氧化碳。耐壓瓶充二氧化碳通過鋼瓶在1.5Mpa和4℃在10min到30min之間。然后鋼瓶在超高

12、壓的環(huán)境中。耐壓瓶被轉移到高壓中，細胞嚴重變形當在超高壓釜中。在剛瓶允許的內外壓能夠被精確計量為了保證在壓力下能夠使二氧化碳溶解和使細胞變形在超高壓下！壓力等級在1升的高壓容器中，其容器內徑為75mm，240mm的高度和高壓泵。這容器加熱和冷卻主要是通過容器壁。壓力是通過液體作為傳遞介質的。在實驗開始時，細菌樣本和壓力介質要預先加熱到實驗溫度通過熱水溫度。在加壓過程中，容器器壁的溫度在20℃到30℃之間。加壓時間和泄壓時間在10s之內。

13、這樣本在鋼瓶中將經(jīng)歷溫度升高12℃和升壓400Mpa然后溫度下降。絕熱加熱的影響在加壓處理中是熱傳導。因為熱量將會消散，其最后的溫度將降低4-6℃，這溫度是指的的是初始溫度。作為對比，樣品在沒有二氧化碳處理是無菌的在30ml的無菌瓶</p><p>　　表1 二氧化碳的溶解在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的在無超高壓處理的滅菌的影響</p><p>　　2.3 二氧化碳濃度的測量</p&g

14、t;<p>　　我們的目的之一是在不同二氧化碳濃度和超高壓的協(xié)同作用的殺菌作用。因此，測量準確測取二氧化碳濃度是很重要的，以便于確定實驗條件。二氧化碳在鋼瓶中的釋放出的二氧化碳導入150ml的0.5M氫氧化鈉溶液中通過吸收和中和反應來確定二氧化碳的濃度。吸收二氧化碳后的溶液，溶液中主要是碳酸氫鈉因為氫氧化鈉是過量的，過量的氫氧化鈉是通過0.5M的氯化氫來中和的。滴定的終點PH分別為8.32和3.89.樣品中二氧化碳濃度計算

15、和釋放是標準的（NL/L），二氧化碳的在標準20℃狀態(tài)下的壓力是1atm。</p><p>　　Fig.2金黃色葡萄球菌（A和C）和大腸桿菌（B和D）在壓力處理和不同二氧化碳濃度在30℃（A和B）和20℃（C和D）10min</p><p><b>　　2.4 生存能力</b></p><p>　　細胞懸浮液連續(xù)的被稀釋，并且1ml的稀釋液被導

16、入含有瓊脂的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)24h，菌落數(shù)就可以被計量。微生物的生存率的表達是通過log（N/N0）來表達。</p><p>　　Fig.3 二氧化碳濃度對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滅活作用在350Mpa和250Mpa在30℃下10min</p><p>　　2.5 固定和標準電子顯微鏡的觀察</p><p>　　所有處理和未處理的細胞懸浮液在3500轉

17、下離心10min然后再懸浮在PBS緩沖鹽溶液中。懸浮液被棄掉來固定離心后的細胞膜，細胞膜立即被預定用0.1%戊二醛100mM，PH7.4，，1h然后用0.5%的戊二醛2h。離心管用10mM的PBS淋洗。這樣品然后用濃度遞增的30%，50%，70%，80%，90%，95%和100%乙醇脫水2次。這樣，細胞將被凍干，在標準電子顯微鏡下觀察。</p><p>　　2.6細胞染色和熒光觀察</p><

18、p>　　細胞膜滲透性的變化用碘化丙碇染色，樣品將被離心和離心后在PBS中懸浮。圖A1.5mM的碘化丙碇在PBS中增加到濃度75mM。然后通過碘化丙碇細胞懸浮液用流式細胞儀下觀察。黑白圖像表明了總的細胞量。熒光的強度代表了膜滲透的變化。每次測量，至少300個細胞被計量。</p><p>　　未處理的 處理</p><p>　　

19、250Mpa和二氧化碳 350Mpa和二氧化碳</p><p>　　250Mpa無二氧化碳 350Mpa無二氧化碳</p><p>　　Fig.4標準電子顯微鏡下觀察大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。（A）（B）（C）是大腸桿菌細胞。（A）是未處理的（B）是3.2NL/L二氧化碳和250Mpa和

20、（C）250Mpa圖（D）（E）（F）是金黃色葡萄球菌。（D）是未處理的（E）在3.8NL/L二氧化碳和350Mpa和（F）是僅在350Mpa下。所有的HHP超高壓處理下30℃下10min。</p><p><b>　　3 結果</b></p><p>　　3.1 二氧化碳的作用和大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生存能力</p><p>　　為了確定

21、溶解二氧化碳對兩種細菌的生存能力的影響，細菌懸浮在沒有超高壓處理的二氧化碳溶液中（條件是溫度30℃）。結果顯示在表一中。在前4h，金黃色葡萄球菌含量保持不變和大腸桿菌增加一點。8h后對這兩種細菌的的含量都有所減少。溶解的二氧化碳在這些濃度下表現(xiàn)出了殺菌作用但是在最適宜的溫度下24h內的沒有體現(xiàn)殺菌因素的影響。</p><p>　　3.2 超高壓和二氧化碳的協(xié)同作用對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的殺菌作用 </

22、p><p>　　金黃色葡萄球菌浮液液在不同二氧化碳濃度下和沒有二氧化碳和250Mpa到</p><p>　　440Mpa下處理10min。結果顯示在圖2A中。沒有二氧化碳處理的樣品顯示出了高的滅菌效果在前期的報告中。在30℃下440Mpa金黃色葡萄球菌處理后，滅活效果僅僅為1.7個對數(shù)級。在30℃下2.6,2.8,5.5NL/L三種不同二氧化碳的濃度下和超高壓一起處理細菌。由于細菌懸浮在溶解的

23、二氧化碳的介質中，協(xié)同作用非常明顯,在30℃時350Mpa下滅活效果達7個對數(shù)級。與在僅在350Mpa下處理滅活效果只能達到0.9個對數(shù)級，二氧化碳的協(xié)同作用使滅活效果達6個對數(shù)級。</p><p>　　大腸桿菌懸浮液在100到440Mpa下超高壓處理，在有和沒有二氧化碳下處理。在圖2B中所示，協(xié)同作用明顯體現(xiàn)在150Mpa下，在300Mpa和1.2NL/L和250Mpa和3.2或4.5NL/L二氧化碳條件下滅活

24、效果達8個對數(shù)級。結果顯示出大腸桿菌比金黃色葡萄球菌對壓力更敏感。由于壓力在250到300Mpa下變化，協(xié)同作用仍然能夠造成6個對數(shù)級的下降當與僅僅壓力處理時。由于一個相似的滅活等級，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在250Mpa比報告中的600Mpa和500Mpa小，僅僅在超高壓處理細菌時。</p><p>　　對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌協(xié)同作用的滅活效果下降的很明顯在20℃時，顯示在Fig.2C和D中。我們選出2種

25、最高二氧化碳濃度的前2組實驗中觀察溫度的影響。對金黃色葡萄球菌來說，相同的二氧化碳濃度在5.5NL/L和350Mpa下，在30℃時滅活效果達7.8個對數(shù)級，而在20℃時只有3.5個對數(shù)級（Fig.2C）。對大腸桿菌，在相同的二氧化碳濃度4.5NL/L和250Mpa下，在30℃僅有8.2個對數(shù)級，而在20℃時僅有3.9個對數(shù)級（Fig.2D）。當溫度從30℃減少到20℃時，大腸桿菌的壓力得從250Mpa上升到350Mpa。</p&g

26、t;<p>　　3.3二氧化碳的濃度對協(xié)同作用的影響</p><p>　　在30℃時金黃色葡萄球菌和大腸桿菌僅在超高壓350和250MPa下處理滅活效果不明顯，這造成0.9和1.8的對數(shù)級的下降。滅活等級的迅速增加隨著二氧化碳濃度的上升，對金黃色葡萄球菌在二氧化碳濃度在5.5NL/L和大腸桿菌在二氧化碳濃度3.2NL/L達到最大的滅活效果在Fig.3。對金黃色葡萄球菌來說，要達到高的協(xié)同效果，需要稍

27、高的二氧化碳的濃度。換句話說，金黃色葡萄球菌比大腸桿菌在協(xié)同處理和僅超高壓處理有抵制力更大。</p><p>　　3.4 僅超高壓處理和協(xié)同處理對細胞形態(tài)的變化</p><p>　　大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的標準電子顯微鏡圖在顯示在Fig.4中。未處理的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌顯示出圓滑的細胞（Fig.4A和D）。在經(jīng)過僅超高壓處理和超高壓和二氧化碳協(xié)同處理細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化。大腸桿菌

28、在250Mpa下和二氧化碳處理后顯示出細胞嚴重的變形和粗糙的表面和很多凹的表面和破裂的細胞，然而僅在壓力250Mpa下細胞形態(tài)仍舊光滑和連續(xù)（Fig.4C）。表2顯示出在超高壓和二氧化碳一起處理細菌能夠引起近100%細胞形態(tài)的變化。標準電子顯微鏡仍舊顯示出金黃色葡萄球菌在350Mpa下主要維持他們的形貌除了一些凹陷（Fig.4F）。然而，在二氧化碳處理下在相同的壓力下，嚴重的內陷和收縮在細胞中發(fā)生，表明了細胞膜的變化和破壞（Fig.4E

29、）。沒有細胞被破壞在SEM實驗中，這是在前期試驗報告中所不同的。</p><p><b>　　3.5 細胞膜完整</b></p><p>　　Fig.5表明了細胞膜滲透性的變化通過不同的處理。未處理的樣品被表明了沒有沒PI染色。在僅超高壓處理的細菌只有一小部分的細菌被PI染色，這表明了絕大部分細菌任然保持了細菌細胞的完整性。在溶解二氧化碳和超高壓處理的細胞膜滲透性的變

30、化從0.12變化到0.87和0.05變化到0.69對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在二氧化碳寧都在3.2NL/L和3.8NL/L條件下。然而，滲透性的變化不能達到完整的的滲透性的變化，然而在溫度處理條件下，滅活可以達到完整的程度。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　金黃色葡萄球菌，球形，革蘭氏陽性兼厭氧性細菌，是以一種最耐高壓的細菌。據(jù)報道，

31、金黃色葡萄球菌，在超高壓400Mpa下造成大約1個對數(shù)級的滅菌效果，在僅在600Mpa下滅菌效果非常明顯。當超高壓與低濃度的二氧化碳在5-6%在溶液中，滅活效果可以降低到500Mpa。在研究中，我們觀察到，滅活等級超過7個對數(shù)級對金黃色葡萄球菌來說在350Mpa下。然而，隨著二氧化碳濃度的增加，不需要更大的壓力來發(fā)現(xiàn)明顯的滅活效果。</p><p>　　大腸桿菌被選作研究的細菌之一是因為在食品中很常見，大量存在的

32、革蘭氏陰性細菌并且對各種抗生素不敏感。在我們實驗中，大腸桿菌表現(xiàn)出了和金黃色葡萄球菌在超高壓和低的二氧化碳濃度下相似的敏感性。這2種菌種的這些表現(xiàn)在前期的報告中，表現(xiàn)出了一定的區(qū)別。對大腸桿菌來說，在250Mpa下二氧化碳的濃度處理后，滅活將達到6.4個對數(shù)級，這表明了不同于抗菌素的滅活模式。我們將這歸納為二氧化碳滲透細胞膜在超高壓的條件下。另外，處理溫度對協(xié)同滅活具有很重要的意義。一種與溫度相似的影響因素出現(xiàn)在二氧化碳的濃度中。高的溫

33、度能夠提高二氧化碳的擴散和能夠增加細胞膜的流動性來使得滲透性變得更容易。</p><p>　　SEM圖用來顯示細菌細胞形態(tài)的變化，在經(jīng)過不同條件處理后。在我們的實驗中，超高壓在350Mpa和250Mpa下我們發(fā)現(xiàn)一半的殺菌效果對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。很大一部分能夠存活在這些壓力下，包含了一半的殺菌效果在適宜的環(huán)境中。因此，SEM細菌細胞形態(tài)的在（Fig.4C和F）細胞僅在超高壓處理后顯示出了更小的變化和協(xié)同處

34、理相比。在溶解二氧化碳協(xié)同處理后，沒有細菌存活和更嚴重的細胞形態(tài)的變化（Fig.4B和E）。盡管在SEM圖中不能與細菌滅活程度相符合，但能夠顯示出不同處理過程的意義，這能夠顯示出細菌受損的程度。在二氧化碳和超高壓一起處理細菌時，結果仍舊顯示出了細胞破裂的更容易對革式陰性大腸桿菌來說與革式陽性的細菌。</p><p>　　在溶液中二氧化碳濃度在很大程度上取決于溫度、壓力的接觸時間和氣體和液體界面面積。眾所周知,二氧

35、化碳溶于水相,形成碳酸,從而進一步電離出H +離子,從而降低溶液的pH值。研究表明，降低pH值可能會改變酶構象和膜透性的影響,這將增加細菌對高壓力的敏感性。討論pH值在實驗中的影響,化學　　方程和標準平衡常數(shù)(命名為KΘ25°C) ，二氧化碳溶解反應可以列出如下:</p><p>　　CO2（aq）+H20（l） H2CO3（aq）， Khθ =1.7*10-3 </p>

36、<p>　　H2CO3（aq） H+（aq）+HCO3-（aq），Ka1θ=2.5*10-4</p><p>　　HCO3-（aq） H+（aq）+ CO32-（aq）， Ka2θ=5.61*10-11</p><p>　　從理論上講,基本的化學平衡方程如下: LnKa = ΔGθ/RT</p><p>　　在反應中Ka

37、是反應的平衡常數(shù),ΔGΘ是嗎標準自由能量的變化。使Ka對壓力的偏導數(shù)，可以得到方程如下:</p><p>　　相比其它作為酸化劑有機酸相比,二氧化碳滅活效應已經(jīng)得到一些作者的闡明。它被廣泛地接受,這主要是二氧化碳在細胞滲透?！【唧w細菌細胞溶液在酸性環(huán)境中重懸浮將有助于微生物失活,這可以歸結為以下兩個方面。</p><p>　　（1）二氧化碳富集于細菌細胞表面。一般來說,因為碳酸的平衡反應常

38、數(shù)很小(1.70×10?3),大多數(shù)的溶解的二氧化碳以分子形式存在，應該考慮為細菌失活的原因。此外,還存在一個集中的重新分配　　二氧化碳在細胞懸浮液中。營養(yǎng)肉湯在我們的實驗中,是均相溶液，在這溶液中細菌細胞懸浮并且形成多相體系。二氧化碳分子擴散向細胞表面和富集在那里由于有利的熱力學因素。因此,二氧化碳在細菌表面的濃度比在液相主體中的濃度高的多。大的比表面積細菌的細胞也有利于濃縮。CO2在細胞表面的聚合解釋如下：二氧化碳的富集會

39、減少細胞膜的水溶性且易于改變離子滲透性，細胞及其外部環(huán)境細胞之間的界面張力被發(fā)現(xiàn)是非常低的,通常不到1dyne每厘米。這樣可以促進新陳代謝的密切接觸交流。周圍的二氧化碳分子會屏蔽這些交往和細胞引起細胞麻醉昏迷,這一般可逆?！?</p><p>　?。?）細菌細胞膜混亂由于在高壓下CO2的滲透和擴散。然而，在高壓下并不是同一種情況，在高壓下會促進小且親脂性的CO2容易滲透進細菌細胞。CO2在分子聚集在細胞表面且形成

40、碳酸，降低細胞內的PH。壓力促進CO2分子的滲透。當壓力被卸下來時CO2能夠從細胞內擴散出來，且破壞細胞膜，這就導致了細胞的變形，在Fig.4B和E中。在高壓下能夠使細菌細胞膜混亂，在高壓協(xié)同CO2處理細菌時，有所提高細胞膜的混亂程度，因而殺菌效果得到提高。</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　總之，該結果表明HHP和CO2協(xié)同處理金黃色

41、葡萄球菌和大腸桿菌滅菌效果非常明顯。一個原始的方案使得能夠成功表明該滅活因素即在懸浮介質中溶解和維持CO2濃度。2個菌種經(jīng)HHP和CO2協(xié)同處理在SEM圖中可知細胞變形很嚴重。細胞膜滲透性可以由PI染色測熒光來表征。結果表明細胞死亡和膜受損與CO2在細胞表面富集和在壓力下向細胞內擴散。CO2便宜且對食物安全且容易移除，能夠很大程度上降低壓力。更多的研究將要被采取為了去研究對細菌滅活的協(xié)同因素。特別是更多的抗藥的,如孢子。目的是為了驗證新