預(yù)設(shè)CDR3導(dǎo)向噬菌體抗體庫(kù)篩選人源化抗人整合素αvβ3單抗E10.pdf

1、噬菌體抗體庫(kù)是把體外隨機(jī)組合的全套抗體基因呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面,通過(guò)抗原的親和力選擇和噬菌體擴(kuò)增獲得特異性抗體基因的技術(shù).該技術(shù)已廣泛用于制備人源單克隆抗體及免疫學(xué)研究.該研究在"抗原定向選擇法"人源化鼠單抗的基礎(chǔ)上探討了一種新的人源化技術(shù)路線,即預(yù)設(shè)CDR3導(dǎo)向噬菌體抗體庫(kù)技術(shù),對(duì)抗人整合素α vβ3單抗E10進(jìn)行人源化.獲得了以下結(jié)果:1.從分泌抗人整合素αvβ3單抗的雜交瘤細(xì)胞E10總RNA中,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增單抗可變區(qū)V

2、H和VL基因,DNA序列測(cè)定表明VH和VL基因分別屬于IgG1和VKⅢ亞群.2.將VH基因與人重鏈恒定區(qū)CH1基因連接,VL基因與人CK連接,分別構(gòu)建了鼠/人嵌合重鏈FD基因和輕鏈基因.將它們克隆入pComb3,構(gòu)建了鼠/人嵌合Fab噬菌體抗體表達(dá)載體,用輔助噬菌體VCSM13超感染,間接ELISA及競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA證實(shí)表達(dá)了能特異性結(jié)合人整合素α vβ3蛋白的鼠/人嵌合Fab噬菌體抗體.3.根據(jù)鼠單抗序列合成含鼠CDR3區(qū)的寡核普酸

3、引物,應(yīng)用重疊PCR及DNA重組技術(shù),將抗人整合素α vβ3單抗E10的CDR3區(qū)與人淋巴細(xì)胞來(lái)源的多樣化的VH和VL組合,構(gòu)建含E10 CDR3的人重鏈FD和輕鏈基因.將鼠/人嵌合FD基因和人輕鏈基因克隆到pComb3載體中,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建雜合噬菌體抗體庫(kù),庫(kù)容為2.1×106,經(jīng)輔助噬菌體VCSM13超感染的噬菌體抗體庫(kù)滴度為8.96×1014cfu/mL.同時(shí)含有輕鏈基因的噬菌體占80%.用整合素α vβ3抗原進(jìn)行四輪的吸附一

4、洗脫一擴(kuò)增,特異性噬菌體抗體明顯得到富集.挑選第四輪篩選后的30個(gè)克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè),獲得10個(gè)能夠與整合素αvβ3特異結(jié)合的克隆.競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示,其中3個(gè)與親本鼠單抗識(shí)別相同的抗原表位.其中,高親和力B12克隆DNA序列測(cè)定表明,所獲得的人源化噬菌體抗體輕鏈基因具有典型的人免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)特征.同源性分析及胚系基因分析表明輕鏈基因?yàn)閂KⅢ基因家族.4.同法將人重鏈FD基因和人源化B12克隆輕鏈基因克隆到pComb3載體中,構(gòu)建

5、了庫(kù)容為2×107人源噬菌體抗體庫(kù),滴度為2.14×1014cfu/mL.人重鏈FD基因插入率為50%.用整合素αvβ3抗原進(jìn)行三輪的淘篩,經(jīng)間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí),獲得了3個(gè)與親本鼠單抗識(shí)別相同的抗原表位且能夠與整合素αvβ3特異結(jié)合的克隆.高親和力D5克隆DNA序列測(cè)定表明,所獲得的人源化噬菌體抗體重鏈FD基因具有典型的人免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)特征.同源性分析及胚系基因分析表明該基因?yàn)镮gG1亞類(lèi).可變區(qū)屬VH1基因家族.該研