SARS冠狀病毒BJ01株全長cDNA的構建及其轉錄體感染性觀察.pdf

1、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約29,700nt，是目前所知的RNA病毒中基因組最大的一類病毒。序列分析表明，SARS病毒明顯區(qū)別于所有已測序的冠狀病毒，其系統(tǒng)發(fā)生關系不屬于目前已知的3組冠狀病毒中的任何一組，為一獨立的分支。目前對SARS-CoV的基因組結構與功能、致病的分子機理等了解甚少，反向遺傳學技術可為深入開展這一領域的研究提供良好的技術支持。 反向遺傳學技術是指由病毒的cDNA克隆

2、獲取RNA病毒的一項技術，包括病毒基因組全長cDNA克隆的構建和感染性轉錄體的制備。但由于冠狀病毒基因組較大，目前無法直接用PCR技術擴增出全長cDNA分子，而且構建基因組全長cDNA克隆必須使用大容量的載體，這就使全長cDNA克隆的構建較為困難。因此，本研究采用分段克隆、體外拼接及體外轉錄的策略開展了SARS病毒感染性轉錄體的制備工作。 首先，對RT-PCR擴增SARS病毒基因組長片段cDNA的條件進行了優(yōu)化。利用RNA制備試

3、劑盒從病毒感染的細胞中提取總RNA，以SuperscriptⅡ進行反轉錄，合成第一鏈cDNA，然后用LADNATaq聚合酶進行cDNA片段的擴增。反應體系中采用不同的Mg2+、dNTP、引物和模板濃度以及不同的反應參數(shù)分別進行長片段cDNA的擴增，最終確定了擴增SARS病毒基因組長片段cDNA的最佳反應體系和參數(shù)：10×Buffer(Mg2+，37.5mM)緩沖液5μL，dNTP(10mM)2μL，LATaq聚合酶(2.5u)1μL，上

4、下游引物各1.5μL，模板2μL，加水至50μL。擴增條件為：94℃2min;94℃30s,55℃45s,72℃3.5～7min(依片段長度而定，1kb約需1min)，擴增28個循環(huán)，每個循環(huán)延伸時間遞增1s；最后72℃延伸7min，4℃保存。該反應條件具有很好的重復性。 其次，對病毒全基因組進行分段擴增和克隆。利用SARS病毒BJ01株基因組序列上的特異酶切位點(BglI)和采用沉默突變引入BglI位點的方法設計了7對引物。擴

5、增的7個cDNA片段其大小分別為1.5kb，2.8kb，4.3kb，3.3kb，6.Skb，4.5kb和6.3kb。同時，在基因組5’端引入T7啟動子核心序列，以使其能夠進行全長cDNA分子的體外轉錄。將擴增的覆蓋病毒全基因組的7個cDNA片段進行回收純化后，分別將F1片段克隆至pGEM-TEasy載體，將F2～F6克隆至pCR-XL-TOPO載體，將F7克隆至pWSK29載體構建SARS病毒亞cDNA克隆，并通過序列測定進行陽性克隆的

6、篩選。最終構建出了F1-3-Teasy，F(xiàn)2-6-Topo，F(xiàn)3-17-Topo，F(xiàn)4-10-Topo，F(xiàn)5-1-Topo，F(xiàn)6-7-Topo和F7-pWSK297個重組質粒。 在此基礎上，對7個重組質粒進行大量提取、純化、酶切和回收。然后分別將F1～F4和F5～F7進行體外連接獲得SARS病毒基因組5’和3’端半分子cDNA，并對接頭處序列進行了PCR擴增和序列測定。再將5’和3’端半分子cDNA進行體外連接，從而獲得了SAR

7、S病毒BJ01株基因組全長cDNA分子。以獲得的全長cDNA分子為模板直接進行體外轉錄，轉錄體轉染Vero-E6細胞后每天觀察細胞狀態(tài)。結果在轉染后84h，細胞出現(xiàn)空泡、聚集成團、變圓拉網等細胞病變。將收集的病毒培養(yǎng)液上清重新接種Vero-E6細胞進行觀察，在72h后也出現(xiàn)相同的細胞病變效應。從出現(xiàn)病變的細胞中提取總RNA，對恢復病毒基因組序列的13038～14170nt和27229～28332nt兩個區(qū)段進行RT-PCR擴增和測序，結