CDCA5和Rin1基因在肝癌中的表達(dá)及其意義的實(shí)驗(yàn)室研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)性肝癌在全世界是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高、惡性程度和死亡率高。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多環(huán)節(jié)、多因素、多步驟、多基因參與的過程，肝細(xì)胞最終有不典型增生發(fā)展到肝細(xì)胞癌變，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前部分研究認(rèn)為肝癌的發(fā)生與病毒性肝炎、高黃曲霉毒素、肝硬化、地理環(huán)境因素和基因變異等有密切關(guān)系。
　　由于肝癌患者早期無特異性癥狀，多數(shù)患者在明確診斷是已進(jìn)入中、晚期，盡管手術(shù)、介入、放療及化療等治療手段在治療

2、肝癌方面取得一些重大進(jìn)展，但肝癌患者的生存率及預(yù)后并無明顯改善。因此，進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找防治的新靶點(diǎn)，成為醫(yī)務(wù)工作者的尤為關(guān)注的問題。
　　近年來有許多方法用于肝癌發(fā)生的病因及其發(fā)病機(jī)制的研究，利用DNA序列變異信息(基因多態(tài)位點(diǎn))結(jié)合疾病表型進(jìn)行連鎖或關(guān)聯(lián)分析是目前常用的鑒定致病位點(diǎn)，包括數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）的主要研究策略之一。確定肝癌的致病基因?qū)τ谄湓缙谠\斷、預(yù)防

3、及靶向治療，具有極為重要的意義。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過選取F344大鼠肝癌模型的QTL區(qū)域候選基因CDCA5和Rin1，分析CDCA5mRNA和Rin1mRNA在肝癌組織及其細(xì)胞株中的表達(dá)情況，初步探討CDCA5mRNA和Rin1mRNA在肝癌發(fā)生中的作用。
　　方法：
　　1．選擇候選基因：在Rat Genome Database中，輸入相關(guān)搜索條件，檢索出大鼠肝癌的23個(gè)QLT位點(diǎn)，于肝癌QTL位點(diǎn)重疊

4、最多區(qū)域選擇CDCA5及Rin1作為候選基因。
　　2．動(dòng)物模型：用化學(xué)誘癌劑3’-甲基-4-二甲氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)誘導(dǎo)F344大鼠肝癌模型。
　　3．細(xì)胞來源：本實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞均購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，共4株細(xì)胞。人肝癌細(xì)胞為：HepG3b、Huh7、HepG2，人正常肝細(xì)胞株為：HL-7702。
　　4．人組織標(biāo)本：選擇20例近兩年中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院及廣州市第一人民醫(yī)院原發(fā)性肝癌患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織

5、塊、癌旁組織塊（癌旁組織為距離瘤體邊緣>15cm的組織）。均有病理結(jié)果證實(shí)。
　　5．檢測(cè)CDCA5mRNA及Rin1mRNA的表達(dá)：提取12例大鼠肝癌及正常組織、20例人體手術(shù)肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織、3株人肝癌細(xì)胞株（Hep3B、Huh7和HepG2）及其正常肝細(xì)胞株（HL7702）的總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測(cè)CDCA5mRNA和Rin1mRNA在12例大鼠肝癌組織、20例人肝癌組織及3株人肝癌

6、細(xì)胞系（Hep3B、Huh7和HepG2）及相應(yīng)對(duì)照組織/細(xì)胞系中表達(dá)情況。
　　6．統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。滿足正態(tài)分布或經(jīng)轉(zhuǎn)換后滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分布不滿足正態(tài)時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。
　　結(jié)果：
　　1．選擇CDCA5和Rin1作為肝癌致病基因的候選基因。
　　2．成功構(gòu)建F344大鼠肝癌模型，均有病理結(jié)

7、果證實(shí)。
　　3．CDCA5mRNA在肝癌中表達(dá)上調(diào)，其在雄性大鼠肝癌組織中表達(dá)拷貝數(shù)為雄性大鼠正常肝組織的233.94倍（P<0.05），在雌性大鼠肝癌組織中表達(dá)拷貝數(shù)為雌性大鼠正常肝組織的3169.82倍（P<0.05）；在人體肝癌組織中的表達(dá)拷貝數(shù)為癌旁組織的4.42倍（P<0.05）；在肝癌細(xì)胞株HepG3b的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL-7702的16.44倍（P<0.05），在HepG2中的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL-7

8、702的6.23倍，在Huh7中的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL-7702的7.50倍（P<0.05）。
　　4．Rin1mRNA在肝癌中表達(dá)不一致，其在雄性大鼠肝癌組織中表達(dá)拷貝數(shù)為雄性大鼠正常肝組織的143.93倍（P>0.05），在雌性大鼠肝癌組織中表達(dá)拷貝數(shù)為雌性大鼠正常肝組織的59.02倍（P<0.05）；在人體肝癌組織中的表達(dá)拷貝數(shù)為癌旁組織的0.51倍（P>0.05）；在肝癌細(xì)胞株HepG3b的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL

9、-7702的2.06倍（P>0.05），在HepG2中的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL-7702的2.49倍，在Huh7中的表達(dá)拷貝數(shù)為正常肝細(xì)胞HL-7702的1.16倍（P>0.05）。
　　5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，CDCA5mRNA的表達(dá)與患者性別、年齡、AFP表達(dá)及腫瘤大小無關(guān)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．在大鼠肝癌模型QTL區(qū)域篩選CDCA5mRNA、Rin1mRNA作為肝癌致病基因的候選基因。