光動(dòng)力學(xué)療法治療小鼠Heps肝癌移植瘤免疫效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本課題應(yīng)用光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)對(duì)小鼠肝癌移植瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。觀察PDT對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)和生存期的影響，以及PDT對(duì)荷瘤小鼠全身和腫瘤局部免疫效應(yīng)的影響，探討光動(dòng)力學(xué)療法的免疫效應(yīng)機(jī)理，為肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；觀察PDT與卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)局部免疫治療聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和免疫效應(yīng)的影響，探討聯(lián)合治療的可行性及有效性，為肝癌的臨床綜

2、合治療提供新的途徑和新的思路。 方法:建立小鼠Heps肝癌移植瘤模型96只，待移植瘤的長(zhǎng)徑達(dá)到0.8～1.2cm時(shí)，隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組、PDT組、免疫治療組和光動(dòng)力免疫治療(photodynamicimmunotherapy，PDIT)組，每組均24只小鼠。PDT組每只小鼠尾靜脈注入光敏劑PSD-007 20 mg/kg體重，7小時(shí)后照射腫瘤局部。光斑直徑2cm，功率密度為190～200 mW/cm<'2>，能量密度為170～1

3、80 J/cm<'2>。免疫治療組的荷瘤小鼠腫瘤局部注射BCG 1×10<'7>CFU。光動(dòng)力免疫治療組于PDT后即時(shí)在荷瘤小鼠的腫瘤局部注射BCG1×10<'7>CFU。1.待瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)出后隔日觀測(cè)四組荷瘤小鼠的腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積和治療后14天的抑瘤率；2.記錄接種當(dāng)天開始至荷瘤小鼠死亡的時(shí)間。荷瘤小鼠全部于接種后90天處死，計(jì)算四組荷瘤小鼠90天生存率。3.四組分別于治療后2小時(shí)、24小時(shí)以及7天分批處死6只荷瘤小鼠，瘤組織取材，

4、常規(guī)病理組織學(xué)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。4.四組荷瘤小鼠分別于治療后2小時(shí)、24小時(shí)尾靜脈采血并涂片，測(cè)定其外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；5.取四組荷瘤小鼠治療后2小時(shí)、24小時(shí)以及7天的瘤組織切片，F(xiàn)4/80抗體免疫組織化學(xué)染色計(jì)數(shù)腫瘤局部組織的巨噬細(xì)胞(macrophages，MФ)數(shù)量；6.取四組荷瘤小鼠上述時(shí)間點(diǎn)的瘤組織切片，甲苯胺蘭染色計(jì)數(shù)腫瘤局部組織的肥大細(xì)胞(mast cell，MC)數(shù)量；7.取四組荷瘤小鼠上述

5、時(shí)間點(diǎn)的血清，雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)荷瘤小鼠外周血中的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β的分泌水平。 結(jié)果 1.PDT組、PDIT組以及免疫治療組治療后7天以及14天的移植瘤的體積較荷瘤對(duì)照組均明顯縮小(P<0.01)。PDT組、PDIT組治療后

6、7天以及14天的腫瘤體積較免疫治療組均明顯縮小(P<0.01)。PDIT組治療后7天的腫瘤體積較單純PDT組明顯縮小(P<0.05)。PDT組、免疫治療組和PDIT組治療后14天的抑瘤率分別為97.95％、21.48％、98.26％。 2.PDT組荷瘤小鼠的90天生存率(83.33％)和PDIT組荷瘤小鼠的90天生存率(100％)明顯高于荷瘤對(duì)照組(0)，P<0.05。PDIT組荷瘤小鼠的90天生存率明顯高于單純免疫治療組(33

7、.33％)，P<0.05。而PDT組和PDIT組、PDT與免疫治療組、免疫治療組與荷瘤對(duì)照組的生存率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 3.HE 染色結(jié)果顯示，荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞分布密集，腫瘤組織內(nèi)瘤細(xì)胞壞死、液化少見(jiàn)，腫瘤間質(zhì)無(wú)纖維組織增生，腫瘤內(nèi)僅見(jiàn)少量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。PDT組治療后2小時(shí)可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞退變明顯，核固縮空泡變性，其中大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；PDT后24小時(shí)可見(jiàn)大片腫瘤細(xì)胞壞死，胞膜破裂、崩解，核碎裂、游離或溶解，腫

8、瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清；PDT后7天可見(jiàn)到大片呈凝固性壞死改變的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)消失，被均勻粉染的無(wú)結(jié)構(gòu)物質(zhì)取代。壞死區(qū)外緣均可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死細(xì)胞間可見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生，其中有不同程度的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。單純免疫治療組治療后2小時(shí)，腫瘤細(xì)胞壞死不明顯，間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療后24小時(shí)，腫瘤組織壞死呈灶樣分布，間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療后7天，腫瘤組織壞死無(wú)明顯變化，間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。PDIT組治療后可見(jiàn)腫瘤組織

9、壞死明顯，較單純PDT組壞死面積更大，伴有大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。 4.荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和分類測(cè)定結(jié)果顯示，治療后2小時(shí)，PDT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量為(8.92±1.03)×10<'9>/L，PDIT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量為(9.26±1.22)×10<'9>/L，均明顯高于荷瘤對(duì)照組的(4.07±0.55)×10<'9>/L和單純免疫治療組的(4.19±0.69)×10<'9>/L，P<0.

10、01。治療后24小時(shí)，PDT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量為(18.24±3.55)×10<'9>/L，PDIT組的荷瘤小鼠外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量為(19.58±4.13)×10<'9>/L，均明顯高于荷瘤對(duì)照組的(4.07±0.55)×10<'9>/L和單純免疫治療組的(3.97±0.58)×10<'9>/L，P<0.01。 5.免疫組化染色結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后2小時(shí)、24小時(shí)以及7天腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量，均明

11、顯高于荷瘤對(duì)照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組上述時(shí)間點(diǎn)腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量，明顯高于單純PDT組(P<0.05)。單純免疫治療組治療后24小時(shí)和治療后7天腫瘤局部巨噬細(xì)胞數(shù)量，明顯高于荷瘤對(duì)照組(P<0.01)。 6.甲苯胺蘭染色結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后24小時(shí)和7天的腫瘤局部肥大細(xì)胞數(shù)量，均明顯高于荷瘤對(duì)照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組治療后2小時(shí)和治療后7天的腫瘤局部肥大細(xì)胞數(shù)量，

12、均明顯高于單純PDT組(P<0.01)。 7.ELISA結(jié)果顯示，PDT組和PDIT組治療后2小時(shí)、24小時(shí)以及7天血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于荷瘤對(duì)照組和單純免疫治療組(P<0.01)。PDIT組治療后24小時(shí)和7天血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于單純PDT組(P<0.05)。免疫治療組治療后2小時(shí)、24小時(shí)以及7天血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平，均明顯高于荷瘤對(duì)照組

13、(P<0.01)。 結(jié)論 1.PDT可使肝癌細(xì)胞變性、壞死，腫瘤體積縮小，達(dá)到殺滅原發(fā)灶的目的，并明顯提高荷瘤小鼠的生存率。 2．PDT后荷瘤小鼠腫瘤局部巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯增加，外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量迅速增高，血清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平明顯增高。提示PDT可增強(qiáng)荷瘤宿主全身和腫瘤局部的免疫力。 3．PDT聯(lián)合局部注射卡介苗的治療方法可明顯抑制小鼠肝癌的生長(zhǎng)，提高荷瘤小鼠的生存率。聯(lián)