桑樹雌花形成中乙烯作用機制的研究.pdf

1、花性調控的研究一直以來是生物學家關注的熱點，果桑，葉用桑，生態(tài)桑等不同用途品種的開發(fā)對桑樹花性別要求不同。桑樹種質資源研究的傳統(tǒng)方法為通過雜交育種篩選出優(yōu)良性狀，然后通過無性繁殖（扦插或嫁接）的方式增加群體數量。雜交育種存在周期長，效率低的缺點，對于不同需求品種的開發(fā)，如果能通過分子學手段在植株生長早期鑒定到其性別，將縮短育種周期，避免育種與生產中的浪費。因此，對桑樹花性調控的研究具有極大地理論價值和經濟價值。
　　乙烯是一種重要

2、的氣體植物激素，參與調節(jié)多種植物生長、發(fā)育過程，并能響應多種外部信號，如種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、果實成熟、葉片衰老、花性分化和抵抗生物與非生物脅迫等。乙烯作為植物的性別激素調控花器官性別分化，黃瓜的兩個性別決定基因（F、M）經鑒定為乙烯合成的限速酶ACS家族的基因。
　　桑樹花性分雌花、雄花、雌雄同花、雌雄同穗等，根據每株樹開花的不同又分為雌雄同株，雌雄異株。桑樹花性的主要決定因素是遺傳因子。另外桑樹花性也受到激素、環(huán)境等因素的影響。

3、偏雄性的植株在噴施乙烯利后，出現了更多的雌花，而使雄花減少。赤霉素與乙烯利作用相反。構建桑樹花芽性別分化時期的基因連續(xù)表達譜，將有助于研究乙烯與雌花發(fā)育的關系，并為篩選性別決定基因，構建同基因型雌雄異株育種材料等提供豐富的研究數據，加快桑樹育種速度。
　　本研究首先通過生物信息學的方法鑒定了桑樹中乙烯合成與信號傳導相關的基因，結合多種軟件分析了其基因結構，保守結構域和系統(tǒng)發(fā)生關系。進一步檢測其在六個不同組織（根、皮、葉、雄花、雌花

4、、果）中的表達模式。我們還鑒定了響應乙烯信號的AP2/ERF轉錄因子家族的基因，分析了其序列信息及在多種組織中的表達情況。隨后我們選取了開雌花的珍珠白作為實驗材料，用石蠟切片的方法確定了其花芽發(fā)育時期形態(tài)變化，從中選擇包括花性分化時期的6個樣本進行轉錄組測序，對測序結果進行了差異基因分析，KEGG功能富集分析，聚類分析，并重點選取激素相關基因、AP2/ERF家族基因和MADS-box家族基因進行了表達分析，隨后選取特異表達基因進行了共表

5、達分析。通過原位雜交的方法研究了乙烯合成關鍵基因在花芽中的表達位置。通過乙烯利（分解生成乙烯）和AVG（抑制乙烯的合成）兩種藥物處理珍珠白花芽檢測了AP2/ERF家族基因表達的變化。最后構建了4個AP2/ERF轉基因過表達載體，在煙草中驗證其功能。本研究所獲得研究結果如下：
　　1、桑樹乙烯合成與信號傳導相關基因鑒定及生物信息學分析
　　結合使用blast與HMM search兩種方法在川?；蚪M中共鑒定到29個乙烯合成與信

6、號傳導相關基因及116個 AP2/ERF家族基因。基因位置顯示 MnEIN3、MnEIL1和MnEIL4、MnEIL5分別都定位在桑樹基因組的同一個scaffold上。對四個較重要家族（ACS、ACO、ETR、EIN3）的基因進行了克隆驗證?；蚪Y構預測顯示桑樹中這四個基因家族，除了MnEIL4外，其他基因與以往研究的同源基因具有一致的基因結構。結構域分析顯示MnACS5由于C末端缺失，缺乏相應的磷酸化位點，其他MnACS家族基因都含有

7、保守的功能基序。MnACO家族基因都含有保守的功能基序。ETR家族中MnEIN4在N端含有一個信號肽結構，MnERS1蛋白C末端相對其他成員較短，導致其缺失一個信號接收結構域。MnEIN3家族中，除保守的結構域外，MnEIN3和MnEIL1還含有在綠豆基因中發(fā)現的兩個保守的富含谷氨酸和天冬氨酸的區(qū)域。檢測這四個基因家族在六個桑樹組織（根、皮、葉、雄花、雌花、果）中的表達發(fā)現，基因表達模式多樣，同時有一些組織特異表達的基因，其中MnACS

8、5在雌花中特異表達。MnACO1和MnACO2在果實中特異表達。MnEIN3和MnEIL1在根和果中顯示更高的表達。
　　AP2/ERF轉錄因子響應乙烯信號，按結構分為5個亞家族。各亞家族基因數目為ERF(58)、DREB(33)、AP2(21)、RAV(3)、Soloist(1)。按系統(tǒng)發(fā)生樹分析又分為15個群。DREB亞家族包括（I-IV）群，ERF亞家族包括（V-X）群。其中V群基因中，桑樹有11個成員，而擬南芥中僅含有5個

9、成員。檢測含有EAR（DLNXXP、LXLXL、LDLNLXPP）基序的基因顯示，含 LXLXL基序的基因數目最多，另外MnERF亞家族含EAR基序的基因主要集中在MnERF-B1亞群。基因表達模式表明其有不同的表達模式。其中MnERF-B3-21在雄花中特異表達，MnDERB-A4-7在葉中更豐富，MnAP2-5在雄花中有高水平表達，另外有9個基因在任何組織中都沒有檢測到表達，推測這些基因響應某種特殊的外界刺激或內部環(huán)境信號。

10、　　2、桑樹早期花芽發(fā)育形態(tài)變化及轉錄組分析
　　選取僅開雌花的珍珠白做為實驗材料，通過石蠟切片技術觀察其花芽發(fā)育時期的形態(tài)變化，選取其中包括花性分化時期的6個花芽樣本（flwoer bud，FB）進行轉錄組測序，分別命名為 FB1-FB6。測序結果顯示共得到118584個contigs與87719個unigenes。其中unigenes的平均長度為727 bp，中間長度為381 bp，最大長度為16738 bp，N50和N90分

11、別為1307 bp和282 bp。功能注釋結果顯示有45.44％的基因可以至少在一個數據庫中得到注釋，其中在 Nr庫中得到注釋的基因最多（39.64%），僅有6.78%的基因在所有數據庫中都能得到注釋。通過blast和estscan分別得到35536（40.5%）條和26726（30.4%）條可編碼蛋白質的序列。我們采取兩種方式尋找差異基因。第一種為相鄰時間點間差異表達基因，數目為808個。第二種為其他時間點與FB1之間差異表達基因，數

12、目為1037個。所有差異基因一起聚類分析顯示大多數差異基因在FB2和FB3上調，隨后被下調表達。
　　差異基因KEGG富集分析顯示FB1與FB2之間的差異基因顯著富集在植物激素信號途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、α-亞麻酸代謝、磷酸肌醇代謝和類黃酮合成五個途徑。而在FB3和FB4之間的差異基因同樣富集在除類黃酮合成之外的四個途徑。植物激素信號途徑KEGG通路顯示，在FB1與FB2之間的差異基因中，乙烯信號途徑的EBF1/2基因發(fā)生了下調

13、表達，暗示了EIN3轉錄本可能得到積累并激活了下游的響應因子。
　　激素相關基因表達分析顯示乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達迅速升高，而生長素中部分基因也在這個時間段高表達。油菜素內脂基因主要在 FB2和FB3時期表達，赤霉素基因主要在FB4-FB6表達較高，脫落酸基因主要在FB6表達較高。
　　AP2/ERF家族基因表達模式多樣，其中有一部分僅在FB2和FB3表達較高。而在MADS-box家族中有接近一半基因的F

14、PKM是隨時間逐漸增加的。我們分別以這兩類基因作為特征表達模式，與所有在任一樣本中FPKM>5的基因進行共表達分析，鑒定到具有強關聯(lián)的兩群基因（P19對應AP2/ERF，P24對應MADS-box）。構建網絡圖顯示 P19中200多個基因之間顯示強關聯(lián)度，P24網絡圖顯示了相對松散的結構，其中具有40個以上鏈接的基因僅有一個，20-40個鏈接的基因有2個，10-20個鏈接的基因有10個。
　　3、珍珠白MaACS2與4個AP2/E

15、RF基因功能分析
　　MaACS2原位雜交結果表明其主要在花序的外圍表達，切片形態(tài)數據顯示在這個階段花芽中花器官開始分化，這些結果暗示桑樹花芽性別分化過程中乙烯合成量增加，推測單性花形成屬于第一種花性別分化模型，即在花器官發(fā)育早期形成兩性起始原基，隨后雌花中的雄蕊原基發(fā)育受到抑制，這個過程可能是乙烯在花器官分化早期大量形成的結果。TENUL檢測顯示在花萼內側有顯著的綠色熒光信號，暗示乙烯通過導致細胞凋亡抑制雄蕊的發(fā)育。
　　

16、采用AVG與乙烯利處理FB2時期的花芽，隨后檢測有關基因的表達，結果顯示乙烯利處理后MaDREB-A1亞群在第7天表達顯著升高；而AVG處理后，相關基因表達與以往研究不一致。在煙草中異源表達AP2/ERF基因導致煙草花發(fā)育異常，花瓣發(fā)育不全，雌蕊突出，雄蕊數量減少且部分雄蕊發(fā)育異常。
　　本研究通過生物信息學的方法在川?；蛑需b定到29個乙烯合成與信號傳導相關基因，序列分析表明，其在序列結構，保守結構域和系統(tǒng)進化等方面與其他物種具

17、有較高的保守性，暗示其可能發(fā)揮同樣的功能。珍珠白花芽早期發(fā)育形態(tài)變化及轉錄組分析，顯示在花芽中花器官分化時期有大量基因表達變化劇烈。乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達顯著增加，生長素協(xié)同乙烯一起發(fā)揮作用，暗示乙烯在雌花發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。MaACS2原位雜交結果顯示其表達在花序的外圍。TENUL檢測顯示花萼內側存在細胞凋亡現象，轉基因煙草花發(fā)育異常，這些結果暗示珍珠白雌花發(fā)育過程中，乙烯可能通過引起細胞凋亡發(fā)揮抑制雄蕊，促進雌