T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤6號(hào)染色體長(zhǎng)臂雜合性缺失的研究.pdf

1、T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)是一種相對(duì)少見(jiàn)的淋巴瘤，在歐美人群的發(fā)生率約占10％-15％，在亞洲人群中發(fā)生率稍高，達(dá)到30％。T-NHL是一種異質(zhì)性的惡性淋巴腫瘤，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)T-NHL的病理形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)或細(xì)胞分子遺傳學(xué)特征的研究，以及臨床治療研究都十分有限。 人類(lèi)腫瘤的發(fā)病是一個(gè)多步驟多基因異常積累的過(guò)程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活。目前已知人類(lèi)腫瘤基因或基因組的不穩(wěn)定性有多種形式，其中有二種類(lèi)型研究較多：微衛(wèi)

2、星不穩(wěn)定性(MSI)，主要以DNA錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷為主；另一種為雜合性缺失(LOH)，主要以腫瘤抑制基因(TSGs)失活為主。LOH是指細(xì)胞有絲分裂異常導(dǎo)致一個(gè)與突變基因相對(duì)應(yīng)的正常等位基因丟失。表現(xiàn)為一個(gè)位點(diǎn)兩條等位基因中任一條的丟失。現(xiàn)代研究表明LOH是人類(lèi)腫瘤發(fā)生過(guò)程中導(dǎo)致抑癌基因失活的主要機(jī)制之一，LOH分析常用于在染色體基因排列的遺傳圖譜中標(biāo)識(shí)出假定的或已知的TSGs。 6號(hào)染色體長(zhǎng)臂(6q)LOH在許多實(shí)體腫瘤中已有

3、報(bào)道，如卵巢癌、胸腺癌、惡性黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌和甲狀旁腺腺瘤等腫瘤中均有6q的缺失，而在T-NHL中的報(bào)道相對(duì)較少。為此，我們檢測(cè)48例T-NHL6q14-26上12個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記物的LOH情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，確定與T-NHL相關(guān)的6q上的最小缺失區(qū)(RMDs)，為進(jìn)一步尋找與T-NHL發(fā)病相關(guān)的抑癌基因提供有意義的信息，以求進(jìn)一步闡明T-NHL發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制。 本研究獲浙江省科技

4、廳科學(xué)研究基金和衛(wèi)生廳科學(xué)研究基金資助腫瘤的發(fā)展是多步驟多基因異常積累的過(guò)程，T-NHL的發(fā)生發(fā)展同樣也需要多種機(jī)制的參與，這些機(jī)制可以相互相關(guān)，也可相互獨(dú)立存在。P53和Ki67是傳統(tǒng)認(rèn)為與T-NHL發(fā)生發(fā)展有關(guān)的兩種蛋白，ZAP-70是參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的非常重要的酪氨酸蛋白激酶(PTK)家族成員之一，目前研究發(fā)現(xiàn)其在不成熟的正常B細(xì)胞和部分B細(xì)胞淋巴瘤中也有表達(dá)，不同淋巴細(xì)胞中此種蛋白表達(dá)的差異成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)，ZAP-70

5、蛋白在T-NHL中是否完全表達(dá)還需進(jìn)一步探索，故本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)48例T-NHL中ZAP-70、P53以及Ki67蛋白表達(dá)水平變化，并分析與T-NHL發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)的這些蛋白的異常表達(dá)及6qLOH之間是否存在一定的相關(guān)性，以求更深入地探索T-NHL發(fā)病的多個(gè)復(fù)雜機(jī)制及這些機(jī)制的相關(guān)性。 材料與方法: 1.材料收集 1997-2005年間該醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其他醫(yī)院病理科初步診斷為T(mén)細(xì)胞

6、淋巴瘤的48例病例以及相對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組織48例；其中男35例，女13例，平均年齡50歲。全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)標(biāo)記確定腫瘤的免疫表型，根據(jù)2001年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類(lèi)，同時(shí)參照1992年Keil標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類(lèi)，低度惡性組15例，高度惡性組33例。 2.方法 (1)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)T細(xì)胞淋巴瘤中CD3，CD4，CD8，Bcl-2，CD20，CD

7、45RO，LMP-1，CD30的表達(dá)，確定腫瘤的免疫表型。 (2)常規(guī)蛋白酶K-酚氯仿法提取腫瘤組織和正常對(duì)照組織DNA。 (3)選取6q14-26區(qū)段上的12個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—單鏈長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-SSLP)分析，選取信息性樣本比較腫瘤組織和正常對(duì)照組織等位基因條帶的光密度值變化，以檢測(cè)LOH的發(fā)生，確定發(fā)生缺失的最小重疊區(qū)段，同時(shí)分析6qLOH與腫瘤樣本臨床病理特征的關(guān)系。 (4)選擇2

8、個(gè)可能與T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病相關(guān)的基因(ZAP-70，P53)以及一個(gè)能反映細(xì)胞增5殖活性的標(biāo)記物Ki67，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)這3種蛋白在T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)水平變化，并分析3種蛋白之間以及各蛋白與6qLOH的相關(guān)性。 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行x2檢驗(yàn)和(或)Fisher's精確概率法檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)以及Spearman's相關(guān)性分析。 結(jié)論: 1.6qLOH與T-NH

9、L的惡性程度及EBV感染情況在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有一定的相關(guān)性。 2.6q21-22和6q25區(qū)段可能存在一個(gè)或者多個(gè)候選腫瘤抑制基因，這些抑癌基因的失活可能在T-NHL的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。 3.ZAP-70蛋白表達(dá)的缺失作為一種異常的T細(xì)胞免疫受體表型對(duì)于惡性T細(xì)胞淋巴瘤的診斷具有一定的輔助作用。 4.P53、Ki67與T-NHL的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)，且兩個(gè)指標(biāo)之間存在相關(guān)性。 5.P53與6qLOH之間存在