K562細(xì)胞中hsa-miR-30e靶向BCR-ABL融合基因的初步研究.pdf

1、慢性髓性白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是我國(guó)最常見(jiàn)的一種慢性白血病,主要見(jiàn)于20歲以上的成年人,尤其以壯年居多。盡管CMI.在慢性期發(fā)展緩慢,自然病程可持續(xù)5-6年,但是若病情演變則會(huì)進(jìn)入加速期或直接進(jìn)入急變期。CML一旦發(fā)生急性變,患者的存活時(shí)間往往只有3-6個(gè)月。目前唯一能根治CML的方法是異基因造血干細(xì)胞移植,但由于供者來(lái)源有限、醫(yī)療費(fèi)用高等因素最終只有不到20％的患者能夠進(jìn)行干細(xì)胞移植

2、治療。CML最重要的細(xì)胞遺傳學(xué)特征是存在特異性的Ph染色體(Philadelphia Chromosome),95％的CML細(xì)胞中會(huì)存在Ph染色體。Ph染色體是由第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的ABL基因(9q34)和第22號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的BCR基因(22q11)相融合形成BCR-ABL融合基因。CML中表達(dá)增強(qiáng)的融合基因BCR-ABL編碼一種新的融合蛋白P210BCR-ABL。該融合蛋白具有很強(qiáng)的ABL酪氨酸蛋白激酶(protein tyros

3、ine kinase,PTK)的活性,能通過(guò)激活一些具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白及一些抑制細(xì)胞凋亡的蛋白而促進(jìn)細(xì)胞分化,對(duì)白血病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。近年來(lái)隨著對(duì)CML分子發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入,逐漸形成了針對(duì)BCR-ABL融合基因及P210融合蛋白的特異分子靶向治療的新思路,有助于在治療CML中尋找非移植的根治方法。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約23個(gè)核苷酸(nt)的內(nèi)源性的、非編碼的單鏈RNA分子,它們廣

4、泛存在于從植物、線蟲(chóng)到人類的細(xì)胞中。迄今為止,在動(dòng)植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千個(gè)miRNA基因,目前認(rèn)為在不同物種中,編碼miRNA的基因約占蛋白編碼基因的1％左右,它們通過(guò)與所靶向基因的mRNA的3’UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向mRNA進(jìn)行切割或者轉(zhuǎn)錄后抑制,進(jìn)而作為一類重要的調(diào)控分子,參與對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和死亡的調(diào)控。在正常生理狀態(tài)下,生物體內(nèi)的miRNAs表達(dá)呈嚴(yán)格的組織及發(fā)育階段特異性,如果miRNAs的表達(dá)發(fā)生失調(diào),則可能

5、會(huì)引起各種疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究人員已經(jīng)證明miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。已經(jīng)有研究表明,miR-203在CML及部分ALL(acute lymphoblastic leukemia)中通過(guò)遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)錄水平的沉默,并且導(dǎo)致了其可能的靶基因ABL和BCR-ABL在這些特定血液系統(tǒng)腫瘤中被激活,BCR-ABL融合蛋白表達(dá)增加。而再表達(dá)miR-203則可減少ABL,蛋白及BCR-ABL融合蛋白的表達(dá)

6、,并能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,這為某些血液系統(tǒng)腫瘤的臨床治療提供了新的思路。
　　 本課題基于當(dāng)前對(duì)CML及miRNAs深入研究的基礎(chǔ)之上,探討在CML中是否存在靶向BCR-ABL融合基因的其他miRNAs,并初步篩選鑒定這些miRNAs與融合基因BCR-ABL之間的靶向關(guān)系,為進(jìn)一步研究在CML的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中某種或多種miRNAs如何發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ),也期望能通過(guò)本課題的研究為臨床上對(duì)CML進(jìn)行的干預(yù)治療提供一定思路。

7、　　 本課題首先利用三種不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)可能靶向BCR-ABL融合基因的miRNAs進(jìn)行篩選,然后交集三種預(yù)測(cè)軟件得到的結(jié)果,以犧牲預(yù)測(cè)軟件的敏感性而提高預(yù)測(cè)結(jié)果的特異性的方法獲取三種預(yù)測(cè)軟件共有的預(yù)測(cè)結(jié)果。然后挑選其中的一個(gè)miRNA,并構(gòu)建特異性表達(dá)該miRNA的慢病毒質(zhì)粒。利用包裝細(xì)胞對(duì)慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行包裝并獲取慢病毒上清。以CML的細(xì)胞株K562細(xì)胞為研究對(duì)象,慢病毒上清感染K562細(xì)胞,然后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCT及We

8、stern-blot的方法檢測(cè)感染后K562細(xì)胞的miRNA表達(dá)及融合蛋白的表達(dá)情況,并初步判斷所研究miRNAs與BCR-ABL融合基因是否存在靶向關(guān)系。
　　 本論文主要包括以下三部分內(nèi)容:
　　 第一部分:靶向BCR-ABL融合基因的microRNAs的篩選
　　 首先利用TargetScan、Miranda和PicTar三種不同的生物信息學(xué)軟件對(duì)可能靶向BCR-ABL基因的miRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè),分別得到了

9、35種、12種和9種miRNAs。然后將這種三種預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果取交集,得到了miR-30家族(包括miR-30a/30b/30c/30d/30e)為三種軟件的共同預(yù)測(cè)結(jié)果。同時(shí)根據(jù)PicTar’對(duì)miR-30家族成員的排序得分進(jìn)行分析,認(rèn)為在該家族中,hsa-miR-30e排序得分更高,相比其他家族成員,更有可能靶向融合基因BCR-ABL。故而本研究選擇hsa-miR-30e作為進(jìn)一步研究對(duì)象,探討其與BCR-ABL融合基因之間是否存在

10、靶向關(guān)系。
　　 第二部分:hsa-miR-30e基因的克隆及慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 首先提取正常人全血中的基因組DNA；從NCBI中查找到hsa-miR-30e的初始序列,選取包含hsa-miR-30e成熟序列及其兩端各約200個(gè)堿基的序列,并根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)合成引物；以提取的正?；蚪MDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增miR-30e基因片段；將擴(kuò)增的miR-30e目的片段與T載體相連構(gòu)建pMD-18T-miR30e重組

11、質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli DH5α菌中,并通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取陽(yáng)性克??；對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR,抽提質(zhì)粒后酶切鑒定及測(cè)序鑒定,將鑒定正確的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒；對(duì)慢病毒載體系統(tǒng)的三套質(zhì)粒(包括慢病毒質(zhì)粒pLL3.7、包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.91及衣殼蛋白質(zhì)粒pCMV-VSVG)轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli STBL3菌中,經(jīng)酶切鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒；利用限制性內(nèi)切酶Xho Ⅰ和Hpa Ⅰ分別對(duì)pMD-18T-miR30

12、e重組質(zhì)粒和慢病毒質(zhì)粒pLL3.7進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的片段；利用T4 DNA連接酶對(duì)上述兩種酶切質(zhì)粒的回收片段進(jìn)行連接,構(gòu)建pLL3.7-miR30e重組質(zhì)粒,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli STBL3菌中,抗生素篩選陽(yáng)性克隆,進(jìn)行菌液PCR鑒定,并抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、測(cè)序鑒定；將鑒定正確的pLL3.7-miR30e陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),連同pCMV-dR8.91和VSVG質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌,利用高純度質(zhì)粒提取試劑盒

13、提取三種質(zhì)粒備用。
　　 第三部分:pLL3.7-miR30e慢病毒的獲取及K562細(xì)胞中miR-30e與融合基因BCR-ABL靶向關(guān)系的初步鑒定
　　 使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前一天在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪1×106個(gè)293FT細(xì)胞:將提取的高純度質(zhì)粒pLL3.7-miR30e、dR8.91和VSVG按照質(zhì)量比為20:15:10的比例混合(總質(zhì)量為24μg),按質(zhì)粒DNA混合

14、液與脂質(zhì)體2000比例為1:2.5的比例取60μl脂質(zhì)體,并用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物；轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞48小時(shí)后倒置熒光顯微鏡下觀察,并收集慢病毒上清并過(guò)濾、分裝；梯度稀釋慢病毒上清,感染293FT細(xì)胞,48小時(shí)后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,并計(jì)數(shù)表達(dá)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),根據(jù)公式計(jì)算慢病毒上清滴度約為1×106TU/ml。以U6 snRNA作為內(nèi)參照物,利用購(gòu)買的miRNA套裝引物,應(yīng)用實(shí)時(shí)

15、熒光定量RT-PCR相對(duì)定量的方法檢測(cè)感染前后293FT細(xì)胞中miR-30e表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明感染后293FT細(xì)胞中miR-30e表達(dá)約為感染前293FT細(xì)胞26倍；慢病毒上清感染K562細(xì)胞,并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)感染前后K562細(xì)胞中miR-30e及BCR-ABL融合蛋白的表達(dá)情況。
　　 綜上所述,本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了可能靶向融合基因BCR-ABL的miRNAs,篩選

16、到了miR-30家族,并挑選hsa-miR-30e作為進(jìn)一步研究對(duì)象；正確克隆了表達(dá)hsa-miR-30e的基因片段:成功構(gòu)建了pLL3.7-miR30e重組質(zhì)粒；并通過(guò)包裝獲取了慢病毒上清,計(jì)算其滴度約為1×106 TU/ml；利用所獲得的慢病毒上清感染K562細(xì)胞,并利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western-blot技術(shù)對(duì)感染后K562細(xì)胞中hsa-miR-30e表達(dá)及BCR-ABL融合蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。雖然由于所獲得的慢