雙環(huán)醇對H-,2-O-,2-誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NF-κB活化調(diào)控機制的研究.pdf

1、慢性肝病是一類世界性的嚴(yán)重危害人類健康的疾病，預(yù)防肝纖維化的發(fā)生是這個過程的中間及關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中心事件是由于肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSCs）的激活導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），生成過多、降解相對不足。誘導(dǎo)活化的HSCs的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。越來越多的研究認(rèn)為HSCs的活化和增殖與其凋亡受到抑制有密切的關(guān)系，而核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor ka

2、ppa B，NF-κB）與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。
　　 NF-κB是由Rel蛋白家族p65和p50組成的同源或異源二聚體，其與一種NF-κB抑制物（inhibitor of κB，IκB），結(jié)合，存在于胞質(zhì)內(nèi)而無活性。NF-κB可以被多種刺激物所激活，如TNF-α、IL-1、脂多糖等，這些刺激物可以通過對IκBs的磷酸化而使其降解，并與NF-κB解離，暴露NF-κB的核識別位點，使其進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)下游的靶基因的轉(zhuǎn)錄。ItSCs的活化

3、伴有NF-κB的激活，并在活化中起著重要作用。在靜止態(tài)HSCs中NF-κB并無活性，但在激活態(tài)HSCs中，活性卻持續(xù)存在，因此有理由相信NF-κB可能通過抑制HSCs的凋亡而使活化的HSCs數(shù)量維持在相當(dāng)?shù)乃?，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。
　　 研究表明，NF-κB的抑制劑有抗肝纖維化的作用，說明抑制NF-κB后能使肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。雙環(huán)醇（bicyclol）臨床應(yīng)用于治療慢性乙型肝炎顯示較好的效果。近年研究表明雙環(huán)醇有抗肝纖維化

4、的作用，但其作用機制目前尚未明確。為此，本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以H2O2激活HSCs NF-κB，研究雙環(huán)醇對NF-κB亞單位p65表達(dá)的抑制作用。
　　 目的：研究雙環(huán)醇對H2O2誘導(dǎo)的HSCsNF-κB活化調(diào)控機制。
　　 方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)HSCs，以相同濃度的H2O2（2 μ mol/L）按時間梯度刺激細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR方法檢測NF-κBp65 mRNA表達(dá)，Western blot法檢測N

5、F-κB p65蛋白表達(dá)情況。并用雙環(huán)醇預(yù)處理細(xì)胞后，觀察上述指標(biāo)變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①H2O2對HSCs NF-κB p65表達(dá)的影響：RT-PCR結(jié)果顯示，12h組、24h組mRNA表達(dá)量分別為1.32±0.08，2.15±0.21，與對照組0.53±0.12比較，表達(dá)量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；36h組mRNA表達(dá)量1.82±0.15與對照組0.53±0.12比較，表達(dá)量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)

6、差異，與24h組2.15±0.21比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。Western blot分析結(jié)果顯示，在大約56kD位置出現(xiàn)NF-κBp65特異性條帶。與正常對照組相比， NF-κBP65蛋白表達(dá)均增加，且隨作用時間變化而變化。12h組、24h組蛋白表達(dá)量分別為1.58±0.07，2.34±0.22，與對照組0.61±0.11比較，表達(dá)量增加， P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；36h組蛋白表達(dá)量1.92±0.15與對照組0.

7、6l±0.11比較，表達(dá)量增加，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，與24h組2.34±0.22比較，表達(dá)量降低， P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB1965表達(dá)明顯升高后逐漸下降，表達(dá)于24h達(dá)高峰。因此下面的實驗應(yīng)用終濃度為2.0umol/L H2O2作用HSCs 24h后收集細(xì)胞。
　　 ②不同濃度的雙環(huán)醇對H2O2誘導(dǎo)的HSCs NF-κB P65mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示，

8、0.3mmol/L組、0.5mmol/L組mRNA表達(dá)量分別為1.34±0.03，0.63±0.05，與對照組2.13±0.21比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；1.0mmol/L組mRNA表達(dá)量0.59±0.17與對照組2.13±0.21比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，與0.5mmol/L組0.63±0.05比較，表達(dá)量略有降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。Western blot分析結(jié)果顯示，在大約65k

9、D位置出現(xiàn)NF-κB p65特異性條帶。與對照組相比，NF-κB p65蛋白表達(dá)較對照組均降低，且隨作用濃度變化而變化。0.3mmol/L組、0.5mmol/L組蛋白表達(dá)量分別為1.41±0.06，0.70±0.12，與對照組2.35±0.19比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；1.0mmol/L組蛋白表達(dá)量0.68±0.15與對照組2.35±0.19比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，與0.5mmol/L組0.70

10、±0.12比較，表達(dá)量略減低，但P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB p65表達(dá)逐漸下降，于0.5mmol/L表達(dá)最低。
　　 ③不同時間的雙環(huán)醇對H2O2誘導(dǎo)的HSCs NF-κB p65的mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用。RT-PCR結(jié)果顯示，30min組、60min組mRNA表達(dá)量分別為1.31±0.05，0.74±0.18，與對照組2.16±0.20比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；9

11、0min組mRNA表達(dá)量0.69±0.14與對照組2.16±0.20比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，與60min組0.74±0.18比較，表達(dá)量略有降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。Western blot分析結(jié)果顯示，在大約65kD位置出現(xiàn)NF-κB p65特異性條帶。與對照組相比，0.5mmol/L不同時間作用于HSCs NF-κB p65條帶均變細(xì)，顏色均變淺。NF-κB p65蛋白表達(dá)較對照組均降低，且隨作用時間

12、變化而變化。30min組、60min組蛋白表達(dá)量分別為1.53±0.11，0.79±0.15，與對照組2.33±0.24比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異；90min組蛋白表達(dá)量0.77±0.19與對照組2.33±0.24比較，表達(dá)量降低，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，與60min組0.79±0.15比較，表達(dá)量略降低，但P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。由此可見與正常對照組相比，NF-κB p65表達(dá)逐漸下降，于60min表達(dá)最低。

13、
　　 結(jié)論：
　　 ①H2O2可以引起HSCs NF-κB p65的活化，在相同濃度H2O2（2 μ mol/L）的作用下，NF-κB p65的mRNA及蛋白表達(dá)有時間依賴性，最大表達(dá)量的作用時間點為24h。
　　 ②H2O2對于HSCs NF-κB p65表達(dá)的調(diào)控作用可被雙環(huán)醇呈濃度、時間依賴的方式抑制，并與0.5mmol/L 60min抑制性最強，提示氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)NF-κB激活，雙環(huán)醇有抗氧化作用，這可