丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)ACE2-ANG(1-7)軸減輕博萊霉素導(dǎo)致的大鼠肺纖維化.pdf

1、研究背景：
　　特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis IPF),其病變局限在肺臟,導(dǎo)致全肺彌漫性的纖維化,引起肺組織功能嚴(yán)重受損害及進(jìn)行性加重的呼吸困難,最終導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭。該病病因不明確,研究發(fā)現(xiàn)多種體液因素與細(xì)胞因素參與了肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程,但具體機(jī)制尚未闡明。IPF最終導(dǎo)致進(jìn)行性進(jìn)展的肺組織功能損害及極度呼吸困難,且目前臨床對該病尚缺乏有效的治療手段,因此通常具有較高的病死率。I

2、PF的發(fā)病群體主要為成人、且隨著年齡增加而增高。但因反復(fù)發(fā)生的急性支氣管炎、各種腫瘤疾病、誤服農(nóng)藥等原因,使得該病在兒童這一低齡組的發(fā)病率逐年升高。IPF臨床常規(guī)的治療方法僅僅只能緩解病情,而達(dá)不到完全控制疾病進(jìn)展并最終達(dá)到治愈。因此目前臨床研究的熱點(diǎn)及焦點(diǎn)集中在探尋肺纖維化的致病因素及其發(fā)病機(jī)制,尋找能夠抑制炎癥反應(yīng)、阻止纖維化進(jìn)程,從而進(jìn)一步使得肺纖維化達(dá)到治愈的可能、且副作用低的有效方法。
　　丹參酮ⅡA是從丹參根部提取的脂

3、溶性物質(zhì),它的分子式為C18H12O3。其屬于二萜醌類化合物,具有抑菌作用、抗炎作用、類激素樣藥理作用,臨床多用于治療各種感染性疾病、心血管神經(jīng)系統(tǒng)疾病、皮膚疾病。目前尚不明確丹參酮對肺纖維化是否具有保護(hù)作用。
　　人體內(nèi)主要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng):腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-aldosterone-aldosterone system,RAAS),在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiot

4、ensin converting enzyme,ACE)是RAAS系統(tǒng)的重要成員,可以水解血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)為血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ),AngⅡ在各種炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme2,ACE2)是RAAS系統(tǒng)的另一重要成員,它是ACE的同源物,但其作用與ACE又不同。ACE2可以使AngⅠ及A

5、ngⅡ水解而產(chǎn)生Ang(1-9)和Ang(1-7),從而使AngⅡ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減輕。本實(shí)驗擬觀察丹參酮ⅡA對肺纖維化具有的保護(hù)作用,并進(jìn)一步深入研究其可能的作用機(jī)制,為其在肺纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗?zāi)康模?br>　　1.觀察丹參酮ⅡA對博萊霉素導(dǎo)致的肺纖維化的保護(hù)作用。
　　2.觀察丹參酮ⅡA是否通過ACE-2/ANG-(1-7)軸來減輕博萊霉素導(dǎo)致的肺纖維化。
　　實(shí)驗方法：
　　為觀察丹參酮

6、ⅡA對博萊霉素導(dǎo)致大鼠肺纖維化的影響,將雄性SD大鼠隨機(jī)分成對照組、博萊霉素組和博萊霉素+丹參酮IIA組共三組(n=10)。博萊霉素組經(jīng)氣管內(nèi)滴注博萊霉素(5 mg/kg,50μl)造成肺纖維化模型,博萊霉素+丹參酮IIA組在經(jīng)氣管內(nèi)滴注博萊霉素后1小時腹腔注射給予丹參酮IIA(25 mg/kg/day,共28天)。對照組氣管注入0.9％無菌生理鹽水(50μl)。肺系數(shù)分析:在第7天、14天、28天時間觀察點(diǎn),將大鼠麻醉后切開胸骨取出肺

7、臟,將肺組織用濾紙清潔并計算出系數(shù)。肺組織學(xué)分析:將肺組織石蠟包埋后切成4μm厚的切片,然后分別進(jìn)行蘇木素和伊紅染色(HE)、馬蘇及天狼星紅染色,顯微鏡下觀察肺實(shí)質(zhì)及肺間質(zhì)的改變。免疫組織化學(xué)染色分析ACE2、ANG-(1-7)和TGF-β的表達(dá)。Western-blot實(shí)驗測定ACE-2,TGF-β蛋白表達(dá)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析ACE2與TGF-β的mRNA水平的表達(dá)。ELISA檢測肺組織中ANG-(1-7)含量。

8、>　　實(shí)驗結(jié)果：
　　氣管滴入博萊霉素導(dǎo)致大鼠體重明顯下降,并大大增加了肺組織系數(shù)。經(jīng)丹參酮 IIA治療后明顯遏制了大鼠體重的進(jìn)行性減輕,同時顯著降低了大鼠肺組織的系數(shù)。
　　大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果:HE染色顯示博萊霉素干預(yù)后,隨著時間的延長,肺泡損傷、各種炎細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)增生,而丹參酮 IIA扭轉(zhuǎn)了博萊霉素導(dǎo)致的大鼠肺損傷的這些改變。馬蘇染色顯示博萊霉素導(dǎo)致逐漸加重的肺泡破壞、肺間質(zhì)增厚、成纖維細(xì)胞擴(kuò)散,而丹參酮 IIA可

9、以減輕這些改變。天狼星紅染色顯示博萊霉素組隨著時間的延長,越來越多的III型膠原纖維集聚在大鼠肺組織,而丹參酮IIA明顯減輕了這些改變。
　　免疫組織化學(xué)染色顯示在28天終點(diǎn),博萊霉素導(dǎo)致大鼠肺組織中 ACE-2的表達(dá)顯著減少。丹參酮IIA逆轉(zhuǎn)了大鼠肺組織ACE-2的表達(dá)。通過WB實(shí)驗進(jìn)一步檢測 ACE-2的蛋白質(zhì)水平:博萊霉素組 ACE-2蛋白水平明顯減少,而丹參酮IIA提升了 ACE-2的表達(dá)。PCR實(shí)驗結(jié)果顯示:ACE-2的