縫隙連接蛋白43、1，4，5三磷酸肌醇受體和P2X7受體在出生后不同鼠齡大鼠耳蝸中的表達(dá)變化及其意義的研究.pdf

1、第一部分大鼠耳蝸發(fā)育過程中Connexin43的表達(dá)差異
　　目的:
　　縫隙連接蛋白在聽覺系統(tǒng)中發(fā)揮十分重要的作用。縫隙連接蛋白(Cx)26、Cx30及Cx43突變被證實(shí)會引起非綜合征型遺傳性耳聾。到目前為止，縫隙連接蛋白突變致聾機(jī)制尚不清楚，但了解它們在耳蝸中表達(dá)及分布的變化是解決這一問題的前提條件。Cx26和Cx30在嚙齒類動物耳蝸中的定位表達(dá)已明確，但Cx43至今仍不能確定并且具有爭議。本研究擬通過重新檢測Cx43在

2、出生后不同鼠齡大鼠耳蝸的表達(dá)和分布，初步探討其在耳蝸發(fā)育過程中的作用。
　　方法:
　　依次取出生后1天(P1)、5天(P5)、、14天(P14)、17天(P17)和成年6組不同年齡段的Sprague-Dawley大鼠耳蝸，采用雙重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)染色方法，激光共聚焦顯微鏡觀察Cx43在發(fā)育中的大鼠耳蝸的分布與定位。應(yīng)用Realtime PCR檢測P1、P8、P14大鼠耳蝸蝸軸Cx43mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證我們免疫定

3、位Cx43蛋白的結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　在P1、P5、P8、P14，Cx43在神經(jīng)支配耳蝸感覺毛細(xì)胞的內(nèi)螺旋叢和外螺旋束有特異性表達(dá)，并與耳蝸傳入神經(jīng)標(biāo)記物TUJ1染色有大量的重疊。而P17Cx43在內(nèi)螺旋叢、外螺旋束的表達(dá)消失。Cx43在出生后不同鼠齡耳蝸中的螺旋神經(jīng)元均有表達(dá)。Realtime PCR檢測結(jié)果顯示Cx43mRNA在P1、P8、P14大鼠蝸軸內(nèi)表達(dá)具有差異性，在P8出現(xiàn)一個(gè)高峰，P14下降至最低水平。

4、>　　結(jié)論:
　　在聽覺出現(xiàn)前，Cx43特異性表達(dá)在內(nèi)、外毛細(xì)胞下面的傳入神經(jīng)末梢內(nèi)螺旋叢與外螺旋束，并伴隨耳蝸傳入神經(jīng)發(fā)育成熟的過程，表明Cx43構(gòu)成的縫隙連接在耳蝸傳入神經(jīng)發(fā)育及聽覺神經(jīng)傳遞中發(fā)揮十分重要的作用。各組大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元胞漿中均有Cx43表達(dá)，我們推測SGN可能是Cx43致聾的靶細(xì)胞。
　　第二部分1，4，5三磷酸肌醇受體和P2X7受體在出生后大鼠耳蝸發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)與變化
　　目的:
　　1

5、，4，5三磷酸肌醇受體(IP3R)是細(xì)胞內(nèi)鈣釋放通道之一，其引起的耳蝸細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加在聽覺功能中具有重要作用。本次實(shí)驗(yàn)擬通過研究IP3R在不同鼠齡大鼠耳蝸中的表達(dá)差異，從而探討其在耳蝸發(fā)育發(fā)揮的作用。為了更進(jìn)一步了解胞外Ca2+內(nèi)流通道P2X7受體在耳蝸中的功能，在本研究中我們重新檢測了P2X7受體在發(fā)育中大鼠耳蝸的表達(dá)。
　　方法:
　　依次取出生后1天(P1)、5天(P5)、8天(P8)、14天(P14)和成年5

6、組不同年齡段的Sprague-Dawley大鼠耳蝸，采用免疫熒光染色方法，激光共聚焦顯微鏡和免疫熒光顯微鏡下觀察IP3R和P2X7受體在發(fā)育中的大鼠耳蝸的分布與定位。
　　結(jié)果:
　　P1組大鼠耳蝸Corti器內(nèi)僅Hensen細(xì)胞表達(dá)IP3R。P5組IP3R開始出現(xiàn)在內(nèi)毛細(xì)胞和3排外毛細(xì)胞表達(dá)，并向外延伸至Claudius細(xì)胞，Deiters細(xì)胞未出現(xiàn)IP3R的表達(dá)。螺旋神經(jīng)元及血管紋三層細(xì)胞緣細(xì)胞、基底細(xì)胞和中間細(xì)胞也表達(dá)

7、IP3R。P8和P14組， IP3R在內(nèi)、外毛細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度增高， Deiters細(xì)胞底部也出現(xiàn)IP3R染色。成年期大鼠耳蝸，IP3R集中表達(dá)在內(nèi)外毛細(xì)胞，其在血管紋、螺旋神經(jīng)元表達(dá)明顯下調(diào)。
　　P1組大鼠耳蝸Corti器內(nèi)、外毛細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)P2X7受體。血管紋的緣細(xì)胞，螺旋神經(jīng)元也出現(xiàn)P2X7受體的弱表達(dá)。P12組在Corti器感覺毛細(xì)胞，P2X7受體陽性染色分布出現(xiàn)改變，主要表現(xiàn)在內(nèi)、外毛細(xì)胞表皮板出現(xiàn)強(qiáng)染色，Deiters細(xì)胞

8、開始表達(dá)P2X7受體的染色。血管紋三層細(xì)胞均表達(dá)IP3受體，螺旋神經(jīng)元胞漿強(qiáng)表達(dá)P2X7受體。成年期大鼠耳蝸，P2X7受體表達(dá)模式同P12，在內(nèi)、外毛細(xì)胞，P2X7受體染色仍集中在毛細(xì)胞表皮板。
　　結(jié)論:
　　IP3R在耳蝸Corti器毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的表達(dá)存在隨鼠齡的增加逐漸上調(diào)的趨勢，這表明IP3R參與耳蝸發(fā)育及耳蝸功能的調(diào)控。P2X7受體首次被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)、外毛細(xì)胞表皮板表達(dá)，提示其在毛細(xì)胞聲音轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮十分重要的功能。