單基因遺傳性高膽固醇血癥家系的收集和基因分析.pdf

1、單基因遺傳性高膽固醇血癥包括載脂蛋白B100基因缺陷性高膽固醇血癥(FDB)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9(PCSK9)基因缺陷導(dǎo)致的高膽固醇血癥(FH3)、常染色體隱性高膽固醇血癥(ARH)、罕見(jiàn)的遺傳性高谷固醇血癥(sitosterolemia)以及最常見(jiàn)的低密度脂蛋白受體(LDLR)基因缺陷導(dǎo)致的家族性高膽固醇血癥(FH)。這五種類型的疾病在臨床表現(xiàn)上極其相似，均具有家族性高膽固醇血癥的臨床表型，表現(xiàn)為血漿低密度脂蛋白膽固醇(LD

2、L-C)水平增高、腱和皮膚黃色瘤的出現(xiàn)、患心肌梗死的可能性增大。雜合子FH病人患心肌梗死的機(jī)會(huì)較同齡的正常人明顯增多，而純合子患者在十幾歲甚至幾歲即可能發(fā)生較嚴(yán)重的心血管事件，甚至死亡。其中載脂蛋白B100(apoB-100)、PCSK9、LDLR基因缺陷導(dǎo)致的高膽固醇血癥為常染色體顯性遺傳性疾病，而PCSK9基因突變目前尚未有純合子的報(bào)道。家族性高膽固醇血癥是最常見(jiàn)的單基因常染色體遺傳性疾病之一。其致病的主要原因是LDLR基因存在突變

3、而引起其表達(dá)的LDLR蛋白存在功能障礙。LDLR位于肝細(xì)胞膜表面，可以結(jié)合血液中的LDL-C并內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，使LDL-C在肝細(xì)胞內(nèi)代謝。LDLR基因的缺陷導(dǎo)致LDL-C不能進(jìn)入肝細(xì)胞而在血液中聚集。本研究以一例臨床診斷的顯性遺傳性高膽固醇血癥純合子患者為線索，通過(guò)對(duì)先證者所在家系及相關(guān)資源的收集，初步建立相關(guān)家系資源的收集方法，并采用PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA測(cè)定對(duì)候選基因如apoB-100和LDLR基因進(jìn)行檢測(cè)，以探討該家系發(fā)病的可能分子機(jī)

4、理。 一、家系及相關(guān)資源的收集 目的:是通過(guò)一例臨床診斷遺傳性高膽固醇血癥先證者所在家系資源的收集，初步建立一套行之有效的、系統(tǒng)的、規(guī)范的家系收集方法；為以后更大規(guī)模的內(nèi)分泌代謝疾病的遺傳性家系收集打下基礎(chǔ)。 內(nèi)容和方法:主要包括：疾病先證者的發(fā)現(xiàn)；先證者資料的收集，血液標(biāo)本的采集；現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，家系成員相關(guān)資料和血液標(biāo)本的收集；知情同意。 通過(guò)家系資源的收集，我們得到了先證者及家系主要成員的基本資料以及在知

5、情同意的基礎(chǔ)上采集部分家系成員的血液標(biāo)本，并建立了一個(gè)包含家系系譜資料、臨床資料和DNA庫(kù)的互相關(guān)聯(lián)的資源庫(kù)。 通過(guò)初步分析，先證者和家系的資料顯示：先證患兒血漿LDL-C極度升高，患兒父母血漿LDL-C水平為正常2-3倍，家系系譜分析顯示疾病呈現(xiàn)較為明確的常染色體顯性遺傳方式。分析認(rèn)為該家系可能是FDB或FH家系，先證者可能為純合子，而其父母為雜合子，為進(jìn)一步進(jìn)行基因分析打下基礎(chǔ)。 二、家系的基因分析 目的：通

6、過(guò)對(duì)臨床診斷為遺傳性高膽固醇血癥純合子患者及其所在家系主要成員的相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測(cè)和分析，結(jié)合家系資料和家系系譜，探討該病的分子診斷方法和發(fā)病的可能分子機(jī)制。 方法：以先證者基因組DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)低密度脂蛋白受體(LDLR)基因的全部18個(gè)外顯子和啟動(dòng)子以及載脂蛋白B100(apoB-100)基因含3500-3531位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GeneBank中

7、相應(yīng)基因的正常序列對(duì)比找出突變，通過(guò)克隆(TA克隆)測(cè)序確認(rèn)突變，并對(duì)家系其他成員相應(yīng)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)合該家系成員臨床表型證實(shí)突變。 結(jié)果：在apoB-1003500-3531區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變，而在先證患兒LDLR基因的第4外顯子發(fā)現(xiàn)新的點(diǎn)突變685delA(DelAat685)雜合性腺嘌呤缺失和386A＞G雜合錯(cuò)義突變，其父存在685delA(DelAat685)雜合性腺嘌呤缺失，其母存在386A＞G雜合錯(cuò)義突變