體外構建組織工程軟骨的實驗研究.pdf

1、實驗一、細胞接種密度對軟骨細胞生長和細胞外基質合成的影響 目的：采用纖維蛋白凝膠為載體支架，研究細胞接種密度對纖維蛋白凝膠中的軟骨細胞增殖、細胞外基質合成以及纖維蛋白凝膠體積變化的影響；探討體外構建組織工程軟骨的最佳接種細胞密度。 方法：體外分離培養(yǎng)3周齡兔關節(jié)軟骨細胞，將第3代軟骨細胞與纖維蛋白混合形成軟骨細胞終濃度為：1×106/ml(A組)、10×106/ml(B組)、50×106/ml(C組)的細胞凝膠復合物。動

2、態(tài)觀察和測定復合物大體形態(tài)變化；采用組織化學染色、免疫組織化學染色和掃描電鏡動態(tài)觀察組織形態(tài)結構以及其中的細胞密度、硫酸糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)、Ⅱ型膠原等成分變化情況；應用DMMB分光法測定組織工程軟骨和正常成熟軟骨組織的GAG含量；應用胰蛋白酶和膠原酶消化組織分離出軟骨細胞，計數(shù)軟骨細胞數(shù)量，了解軟骨細胞增殖率。 結果：在細胞-凝膠復合物的制備過程中，軟骨細胞與纖維蛋白凝膠能夠比較均勻地混合，并

3、固化成一定的外形，細胞無損傷，凝膠塊浸泡于培養(yǎng)液中不發(fā)生熔融或崩解。體外培養(yǎng)3周期間內，A組和B組細胞-凝膠塊內的軟骨細胞數(shù)量均逐漸增加，到3周時達到高峰(A組細胞-凝膠塊內的軟骨細胞數(shù)量達到最初接種細胞數(shù)量的4.532倍，B組達到最初接種細胞數(shù)量的2.097倍)。C組細胞-凝膠塊內的軟骨細胞數(shù)量在3天時達到高峰(增殖倍數(shù)為1.147)，以后逐漸減少，到3周時最低(增殖倍數(shù)為0.907)。體外培養(yǎng)期間，C組細胞凝膠塊中的GAG和Ⅱ型膠原

4、的表達均最多；A組細胞凝膠塊中的GAG和Ⅱ型膠原的表達最少。在培養(yǎng)初期，C組的細胞凝膠塊收縮程度最大，A組的細胞凝膠塊收縮程度最小。 結論：較高的軟骨細胞接種密度(50×106/ml)抑制軟骨細胞的增殖，較低的軟骨細胞接種密度(1×106/ml和10×106/ml)促進軟骨細胞的增殖。細胞聚集成高密度促進軟骨細胞功能活性的表達。細胞凝膠塊體積的變化與細胞密度密切相關，較高的細胞接種密度會導致初期組織收縮增大，目前認為軟骨細胞主動

5、收縮是造成細胞凝膠復合物收縮的主要因素，故需要進一步研究細胞密度對軟骨細胞中SMA表達情況的影響。本實驗條件下，50×106/ml為最佳細胞接種密度，但收縮最明顯。 實驗二、脫細胞基質材料為支架構建組織工程軟骨的實驗研究 目的：分別以小腸黏膜下層(Smallintestinesubmucosa，SIS)和脫細胞軟骨基質(Acellularcartilaginousmatrix，ACM)作支架體外構建組織工程軟骨，了解其作

6、為軟骨組織工程支架的可行性。 方法：聯(lián)合應用凍干-反復凍融-酶消化法對牛軟骨基質行脫細胞處理，聯(lián)合應用機械法和去垢劑-酶消化法制備SIS。將體外培養(yǎng)擴增的2～5代軟骨細胞分別接種在上述兩種材料上，體外培養(yǎng)3周，觀察軟骨細胞在支架材料上的生長分布情況。 結果：軟骨細胞在制備的ACM和SIS上可較好地黏附生長并增殖，并且分泌大量Ⅱ型膠原和GAG；但軟骨細胞不能長入到ACM和SIS內部，只能在其表層和表面的結構中生長，另外只有

7、少量軟骨細胞分布在ACM物理方式打出的孔隙中。 結論：ACM和SIS支架材料均具有良好的細胞相容性和表面活性，并且促進軟骨細胞增殖和維持軟骨細胞表型。需要進一步了解ACM和SIS結構和成分對軟骨細胞游走趨化能力的影響，促進軟骨細胞均勻分布在材料上。 實驗三、離心培養(yǎng)在構建組織工程軟骨中的作用目的：選用離心力作為力學刺激因素，研究離心力對軟骨細胞活性、增殖和功能表達的影響，了解離心培養(yǎng)方式在體外構建組織工程軟骨中的作用。

8、 方法：將裝有3代軟骨細胞懸液的離心管移到旋轉半徑12cm的離心機上，在轉速為500r/min、1000r/min和2000r/min的條件下，分別離心30min、60min、90min、120min、150min或180min后計數(shù)細胞總量，臺盼藍染色檢測分離的軟骨細胞活性。將3代軟骨細胞接種在ACM上，分別置于靜態(tài)培養(yǎng)和離心培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)8周，動態(tài)觀察和測定材料表層類軟骨組織形態(tài)變化；采用組織化學染色和免疫組織化學染色動

9、態(tài)觀察組織形態(tài)結構以及其中的細胞密度、GAG、Ⅱ型膠原等成分變化情況；應用DMMB分光法定量測定組織工程軟骨中GAG含量。應用胰蛋白酶和膠原酶消化組織分離出軟骨細胞，計數(shù)軟骨細胞數(shù)量，了解軟骨細胞增殖率。 結果：轉速為2000r/min時，培養(yǎng)時間超過60min，細胞活性＜90％；轉速為500r/min時，軟骨細胞培養(yǎng)120min后，細胞活性仍保持在90％以上。在相應時間點，離心培養(yǎng)下的組織工程軟骨GAG含量高于靜態(tài)培養(yǎng)下的組織

10、工程軟骨GAG含量；雙因素方差分析，培養(yǎng)方式因素效應差異顯著(P＜0.05)，時間因素效應差異顯著(P＜0.05)。體外相同時間段，靜態(tài)和離心培養(yǎng)下的軟骨細胞增殖倍數(shù)不同，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，離心培養(yǎng)下的軟骨細胞增殖速度高于靜態(tài)培養(yǎng)下的軟骨細胞速度。另外，靜態(tài)培養(yǎng)的組織較離心培養(yǎng)的組織Ⅱ膠原免疫組織化學染色較弱。離心力改變了軟骨細胞在脫細胞牛軟骨基質上的空間排列，最終形成的類軟骨組織具有一定層次排列結構，但這種結構與正常軟骨的

11、排列有較大的區(qū)別。 結論：對軟骨細胞施加528g(轉速：2000r/min)離心力，對細胞活性有較大損傷，故不適合于作為體外構建組織工程軟骨的培養(yǎng)條件；施加33g(轉速：500r/min)離心力，對細胞活性影響較小，不會造成軟骨細胞損傷。對軟骨組織所施加的132g(轉速：1000r/min)離心力刺激軟骨細胞合成GAG和Ⅱ型膠原增多，并且促進軟骨細胞快速增殖到達較高的細胞濃度，影響組織的排列結構。離心培養(yǎng)技術構建的組織工程軟骨具