脂多糖激活大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上Toll樣受體4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和辛伐他汀的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上Toll樣受體4的表達(dá)和其介導(dǎo)的信號通路的研究 【目的】脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌(GNB)細(xì)胞壁上的主要成分，在GNB感染導(dǎo)致的急危重癥急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)中扮演重要角色。經(jīng)典的理論是LPS和免疫細(xì)胞上Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，介導(dǎo)免疫反應(yīng)。但是有證據(jù)表明TLR4也分布在某些非免疫細(xì)胞上，這些細(xì)胞也能夠被L2S激活，通過分泌炎性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與病理過程。本文探討

2、在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上是否存在TLR4表達(dá)和LPS激活的TLR4介導(dǎo)的信號通路，為ARDS的發(fā)病機(jī)制和治療提供理論依據(jù)。 【方法】體外培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定。用RT-PCR測定各種Toll樣受體家族成員在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的mRNA表達(dá)。用免疫熒光，流式細(xì)胞儀分析TLR4蛋白在細(xì)胞上的定位。用免疫熒光，熒光素酶報道基因和Westerrl blot分析LPS對TLR4信號的激活

3、，用RT-PCR分析TLR4激活以后促炎性細(xì)胞因子TNF-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxidesynthase，iNOS) 的mRNA表達(dá)。用TLR4抗體阻斷技術(shù)和NF-κB的抑制劑Aspirin分析LPS刺激TLR4介導(dǎo)的信號通路。 【結(jié)果】 (1)根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，我們從大鼠肺組織中分離培養(yǎng)得到微血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞為鋪路石形，可以連續(xù)傳2—5代，并表現(xiàn)為Ⅷ因子陽性。

4、(2)各種Toll受體mRNA在正常未受干預(yù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)程度不同，TLR5和TLR9無表達(dá)，而TLR4表達(dá)最高(P<0.01)。 (3)免疫熒光顯示TLR4在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上呈陽性，少量分布在細(xì)胞質(zhì)中，流式細(xì)胞儀表明95％的細(xì)胞顯示細(xì)胞膜上很強(qiáng)的TLR4分布。 (4)用LPS刺激1、3、6小時后JNK、p38表達(dá)均增加(P<0.01)，還引起IκB-α降解(P<0.01)，導(dǎo)致NF-κB的亞基p65入細(xì)胞

5、核。 (5)LPS可以明顯增加TNF-α和iNOS的mRNA的表達(dá)(P<0.01)，呈現(xiàn)時間反應(yīng)，在L2S刺激72小時后TNF-α和iNOS的表達(dá)達(dá)到高峰。 (6)培養(yǎng)基中使用TLR4的抗體和Aspirin可以幾乎完全阻斷LPS引起的IκB-α降解、p65入核以及TNF-α和iNOS mRNA表達(dá)的增加。 【結(jié)論】 (1)TLR4在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的確呈高表達(dá)，并且絕大多數(shù)分布在細(xì)胞膜上。

6、(2)在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上LPS能夠激活TLR4下游多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子JNK、p38和NF-κB，啟動炎性反應(yīng)。 (3)應(yīng)用TLR4抗體和NF-κB抑制劑Aspirin能夠幾乎完全阻斷L2S刺激引起的炎性細(xì)胞因子TNF-α和iNOS的表達(dá)增加，高度提示了在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上LPS是主要通過TLR4介導(dǎo)激活NF-κB而完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，使內(nèi)皮參與活躍的免疫反應(yīng)，在GNB致病過程中進(jìn)一步利用工具藥說明了以往的報道

7、及理論的正確性。 第二部分 辛伐他汀對TLR4受體的表達(dá)和其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的影響 【目的】研究辛伐他汀對TLR4所介導(dǎo)的信號的抑制作用，探討辛伐他汀成為臨床上潛在的抗炎藥的可能性 【方法】體外培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用Western blot分析辛伐他汀處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)。用免疫熒光，熒光素酶報道基因和Wes-terrlblot分析辛伐他汀對L2S—TLR4信號通路的抑制作用。分別用

8、RT-PCR和ELSIA分析辛伐他汀對LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子TNF-α和iNOS的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。 【結(jié)果】 (1)辛伐他汀處理大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞引起TLR4的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，并且作用表現(xiàn)為時間依賴性(P<0.01)，在72小時最明顯。 (2)辛伐他汀抑制了TLR4激活以后的IκB-α的降解，p65的入核和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01)并且這種作用出現(xiàn)在TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)之前。