阻斷泛素—核因子-κB信號(hào)通路防治慢性腎衰加速性動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 心血管疾病是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。其中尿毒癥動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)倍受關(guān)注。慢性腎衰竭患者發(fā)生AS與普通人群不同，具有發(fā)病率高、發(fā)病年齡早、病變累及廣泛等自身特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素如：高血壓、糖尿病、血脂代謝紊亂等雖在CRF病人中也較為普遍，但并不能滿(mǎn)意解釋慢性腎衰竭(chron

2、ic renal failure，CRF)病人心血管疾病如此高的發(fā)病率和死亡率，提示慢性腎衰竭患者體內(nèi)可能有其它因素加速了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。已明確AS實(shí)質(zhì)是血管壁細(xì)胞的慢性損傷性炎癥反應(yīng)，但目前仍缺乏有效的防治手段。ESRD患者具有嚴(yán)重的內(nèi)環(huán)境紊亂，體內(nèi)存在“微炎癥狀態(tài)”，這種微炎癥狀態(tài)可能和其動(dòng)脈血管細(xì)胞慢性損傷性炎癥反應(yīng)有關(guān)，加速了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。 核因子-κB(NF-κB)是一種具有多向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，存在于

3、多種不同的細(xì)胞類(lèi)型中，處于炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心位置，研究其生物學(xué)特性并通過(guò)藥理學(xué)作用適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)控，對(duì)于防治組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞胞漿中非常重要的、依賴(lài)ATP的非溶酶體蛋白降解通路，可從多個(gè)環(huán)節(jié)參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。且UPP組分具有明確的組織特異性，為靶向性地針對(duì)血管細(xì)胞NF-κB活化

4、提供了可能。 本課題通過(guò)建立慢性腎衰兔模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)兩層次觀察UPP-NF-κB信號(hào)組份在慢性腎衰加速性動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)和活化規(guī)律，分析阻斷泛素-蛋白酶體信號(hào)途徑對(duì)慢性腎衰主動(dòng)脈血管細(xì)胞炎癥病理變化的影響，為臨床有效防治慢性腎衰加速性動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。 方法： 1.采用結(jié)扎左腎動(dòng)脈分支并切除右腎的方法建立慢性腎衰竭兔模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、慢性腎衰組(CRF)、假手術(shù)

5、+MG132組(Sham+MG132)、慢性腎衰+MG132組(CRF+MG132)、假手術(shù)組+PDTC組(Sham+PDTC)、慢性腎衰+PDTC組(CRF+PDTC)。各組設(shè)術(shù)后4w、8w、12w三時(shí)相點(diǎn)，動(dòng)態(tài)觀察血壓、腎功能、血脂、腎臟及主動(dòng)脈病理變化情況。 2.采用慢性腎衰模型12 w兔血清刺激體外培養(yǎng)的兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，MTT、流式細(xì)胞儀及Hoechst33342染色檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的形態(tài)增殖、凋亡

6、的變化。并采用MG132和PDTC進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的量效和時(shí)效情況。 3.免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)變化。 4.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)各組兔主動(dòng)脈及體外培養(yǎng)細(xì)胞泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、NF-κBp65及IκBα mRNA表達(dá)變化。 5.Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈及體外培養(yǎng)細(xì)胞泛素化蛋白、E1、NF-κB、IκBα、PCNA及TNFα蛋白表達(dá)變化。 6

7、.免疫熒光檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞NF-κBp65核轉(zhuǎn)位情況。 7.EMSA檢測(cè)NF-κB-DNA結(jié)合活性。 8.特異性熒光底物反應(yīng)檢測(cè)蛋白酶體活性20s亞基活性。 9.ELISA方法檢測(cè)各組兔血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-6、TNFα濃度。 結(jié)果： 1.結(jié)扎新西蘭白兔左腎動(dòng)脈分支并切除右腎的方法建立了慢性腎衰竭動(dòng)脈粥樣硬化的模型：模型組兔術(shù)后出現(xiàn)明顯的蛋白尿和血尿，并逐漸出現(xiàn)貧血；出現(xiàn)明顯的高血壓；血清

8、BUN、SCr逐漸升高；腎臟病理出現(xiàn)明顯的腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。兔主動(dòng)脈逐漸出現(xiàn)脂紋、粥樣斑塊等動(dòng)脈粥樣硬化早中期的變化。使用MG132和PDTC干預(yù)后能明顯減輕主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化的病理變化。 2.慢性腎衰竭兔主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路組分表達(dá)及MG132和PDTC干預(yù)的效果：與Sham相比，NF-κBmRNA和蛋白水平表達(dá)均增加，NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯增強(qiáng)，隨病程延長(zhǎng)更為明顯。其抑制因子IκBα mRNA和蛋白水平表

9、達(dá)和NF-κB呈現(xiàn)相反的變化。MG132干預(yù)后能使NF-κBmRNA和蛋白水平表達(dá)降低；NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯下降；IκBα mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)。PDTC干預(yù)后和MG132作用類(lèi)似，證實(shí)慢性腎衰竭兔主動(dòng)脈內(nèi)存在NF-κB信號(hào)通路的活化。 3.慢性腎衰竭兔主動(dòng)脈泛素-蛋白酶體信號(hào)通路組分表達(dá)及MG132和PDTC的干預(yù)作用：與Sham組相比，慢性腎衰竭兔主動(dòng)脈中Ub mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)、泛素化蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化

10、：E1 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加；蛋白酶體活性明顯增強(qiáng)，且隨病程進(jìn)展更為明顯。MG132干預(yù)后，Ub mRNA表達(dá)下調(diào)，泛素化蛋白表達(dá)增加，E1 mRNA和蛋白表達(dá)下降；蛋白酶體活性下降。證實(shí)慢性腎衰竭兔主動(dòng)脈內(nèi)存在泛素蛋白酶體通路的活化。與MG132相比，PDTC干預(yù)后對(duì)Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表達(dá)與MG132相仿，但對(duì)蛋白酶體活性影響較小，對(duì)泛素化蛋白表達(dá)無(wú)影響。 4.慢性腎衰兔血清中的炎癥因子TNFα、IL-6

11、濃度和兔主動(dòng)脈中TNFα的表達(dá)變化及MG132和PDTC的干預(yù)作用：與對(duì)照組相比，血清中的炎癥因子TNFα、IL-6濃度逐漸升高，主動(dòng)脈中TNFα的表達(dá)逐漸增加。MG132和PDTC干預(yù)后均能降低血清中的炎癥因子TNFα、IL-6濃度和主動(dòng)脈中TNFα的表達(dá)。證實(shí)慢性腎衰竭兔存在全身和主動(dòng)脈局部的微炎癥反應(yīng)。 5.慢性腎衰血清在較低濃度時(shí)(3％～10％)時(shí)呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，較高濃度時(shí)(>10％)，

12、促增殖作用減弱，促細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。MG132和PDTC均能抑制10％慢性腎衰血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖。 6.與正常血清相比，10％慢性腎衰血清能使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)增加，IκBα mRNA和蛋白表達(dá)降低；10％慢性腎衰血清能使NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位；不同濃度慢性腎衰血清(3％～10％)使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性呈濃度依賴(lài)性增加，10％慢性腎衰血清使內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌

13、細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性24h持續(xù)增加。MG132和PDTC干預(yù)后，能抑制10％慢性腎衰血清刺激的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞NF-κBmRNA和蛋白的表達(dá)，增加IκBα mRNA和蛋白表達(dá)，抑制NF-κB DNA結(jié)合活性。 7.10％1熳性腎衰血清使主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6和TNFα含量明顯增加，刺激6小時(shí)后升高幅度最為明顯，以后仍緩慢上升。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)TNFα蛋白表達(dá)也較對(duì)照明顯增加。MG132

14、和PDTC干預(yù)后，均能降低細(xì)胞炎癥因子TNFα、IL-6的分泌和主動(dòng)脈中TNFα的表達(dá)。 8.10％慢性腎衰血清刺激后，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞Ub和ElmRNA的表達(dá)上調(diào)，E1蛋白的表達(dá)增加，蛋白酶體活性較對(duì)照組明顯升高。MG132干預(yù)后，能抑制主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞Ub和ElmRNA的表達(dá)，降低El蛋白的表達(dá)，抑制蛋白酶體活性。與MG132相比，PDTC干預(yù)后對(duì)細(xì)胞Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表達(dá)與MG132相仿

15、，但對(duì)蛋白酶體活性影響較小。 結(jié)論： 1、慢性腎衰竭兔隨病程的進(jìn)展主動(dòng)脈逐漸出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變。 2、慢性腎衰兔主動(dòng)脈內(nèi)存在NF-κB信號(hào)通路的活化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，并隨慢性腎衰病程進(jìn)展呈現(xiàn)出加重的趨勢(shì)。 3、慢性腎衰兔主動(dòng)脈內(nèi)存在泛素-蛋白酶體信號(hào)通路的活化，阻斷泛素一蛋白酶體途徑可顯著抑制慢性。腎衰兔主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路的活化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)；明顯減輕兔主動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變。

16、 4、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能促進(jìn)兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增殖，呈一定濃度和時(shí)間依賴(lài)性；而高濃度的慢性腎衰兔血清對(duì)兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖作用減弱，促凋亡作用增強(qiáng)。 5、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能使兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的活化和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，呈一定的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。 6、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能使兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞泛素