人源抗EHEC O157：H7 Stx2A-,1-噬菌體Fab抗體庫的構(gòu)建及特異性抗體的篩選、表達(dá).pdf

1、腸出血性大腸桿菌(entrerohemorrhagic E.coli，EHEC)0157:H7是一種新型的腸道致病菌，可引起嚴(yán)重的食源性疾病。感染該菌可致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagiccolitis，HC)，還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡

2、[1-3]。 目前，對EHEC0157:H7感染仍缺乏有效的治療方法。臨床上針對其感染主要采用抗生素治療及相應(yīng)的對癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素使菌體破裂，導(dǎo)致0157:H7菌志賀毒素(Shiga toxin，Stx)的釋放水平大大提高，使用抗生素有可能加重病情，增加發(fā)生并發(fā)癥的危險并引起死亡。 EHEC0157:H7主要產(chǎn)生兩種毒素，分別稱為志賀毒素I(Stx1)和志賀毒素II(Stx2)。目前，Stx2與配體腺嘌呤

3、的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)已被解析[5，6]，毒素的活性位點也已明確。A亞單位包括A1和A2兩個片段。A1片段為毒性活性片段，毒力活性中心位點位于第77位酪氨酸上，A2片段插入5個B亞基形成的孔中，通過B亞基與細(xì)胞受體結(jié)合而發(fā)揮毒力作用。因此，直接針對EHEC0157: H7最主要的致病活性分子Stx2A研制其中和毒素抗體，將是研制0157: H7治療性抗體藥物優(yōu)選的設(shè)計策略。但由于鼠源性單抗應(yīng)用人體會引起人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，這為臨床實際

4、應(yīng)用帶來了不便，因此制備特異性人源化抗體是目前待解決的問題?？乖砦欢ㄏ蜻x擇法(EGS)是近年發(fā)展的快速人源化抗體的新方法。該方法通常是先用親本鼠單抗重(或輕)鏈可變區(qū)基因與人源抗體輕(或重)鏈基因庫配對，構(gòu)建成鼠.人雜合噬菌體抗體庫，以固相化抗原進(jìn)行親和篩選，得到與鼠源重(或輕)鏈組合識別特異抗原的人源輕(或重)鏈基因。進(jìn)一步用篩到的特異性人抗體輕(或重)鏈去配人源重(或輕)鏈基因庫，構(gòu)建成人源噬菌體抗體庫，再經(jīng)同一抗原進(jìn)行親和力篩選

5、，從而獲得與親本鼠源抗體針對同一表位的完全人源化的新型抗體。本研究擬采用抗原表位定向選擇法，對構(gòu)建的鼠源抗EHEC0157: H7 Stx2ai噬菌體抗體進(jìn)行人源化改造，從而為解決臨床EHEC0157:H7感染者的治療研究奠定實驗基礎(chǔ)。 第一部分：EHEC O157:H7 Stx2A1亞單位截短片段Stx2a1的克隆、表達(dá)、純化及免疫學(xué)性質(zhì)鑒定 目的：表達(dá)、純化EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亞單位截短片段St

6、x2a1對其免疫性進(jìn)行鑒定。方法：應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAstar對Stx2A1全長序列進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果將全長Stx2Ai羧基端疏水性很強(qiáng)的部分氨基酸截短，從EHEC0157:H799A021基因組中擴(kuò)增stx2ai，克隆于pET-22b(+)載體，轉(zhuǎn)化到工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot分析。結(jié)果：Stx2ai

7、經(jīng)0.1 mM IPTG誘導(dǎo)為可溶形式表達(dá)，SDS-PAGE蛋白電泳表明表達(dá)及純化的蛋白的相對分子量約為25 kDa，純化出的Stx2ai蛋白含量達(dá)98％以上，Western blot鑒定顯示該蛋白可與抗Stx2A單抗SID8特異性反應(yīng)。結(jié)論：成功表達(dá)純化出EHEC O157:H7 Stx2A1毒力亞單位截短片段Stx2a1，這為下一步篩選到抗EHECO157:H7毒力亞單位的抗體奠定了抗原基礎(chǔ)。 第二部分：鼠源性抗EHEC O

8、157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫的構(gòu)建及篩選 目的：以滅活的天然毒素Stx2免疫小鼠制備鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫，篩選鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2aiFab抗體。方法：甲醛法滅活天然毒素Stx2，類毒素免疫小鼠，利用RT-PCR從脾淋巴細(xì)胞擴(kuò)增出全套的鼠Fab抗體的輕、重鏈，克隆入pComb3x噬粒載體中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue后建立鼠源性抗EHECO157:H7

9、 Stx2噬菌體Fab抗體庫。通過稀釋滴定、限制性酶切對所建的抗體庫的庫容、重組率分別進(jìn)行鑒定，以M13K07輔助噬菌體超感染，先用天然毒素Stx2為抗原對挽救展示的噬菌體抗體庫進(jìn)行淘篩和鑒定，然后對篩選到的抗體進(jìn)行抗原亞單位的特異性鑒定，最后對篩選到了針對Stx2a1的Fab抗體的陽性克隆進(jìn)行測序及比對。結(jié)果：成功構(gòu)建1.56×107CFU、重組率為80％的鼠源性噬菌體抗體庫。首先利用純化的天然毒素Stx2進(jìn)行三輪淘選后，對篩選到的抗

10、體再進(jìn)行Stx2a1抗原的特異性鑒定，得到兩個陽性克隆，測序后NCBI中比對及同源性分析表明，其中輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與GenBank中已注冊的鼠免疫球蛋白K輕鏈、重鏈可變區(qū)氨基酸序列同源性為98.5％、99.6％左右。結(jié)論：成功構(gòu)建了鼠源性抗EHEC0157:H7 Stx2噬菌體Fab抗體庫，并篩選到兩株鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫。 第三部分抗天然Stx2毒素活性片段Stx2a1的人源噬菌

11、體Fab抗體庫的構(gòu)建及特異性人源Fab抗體的篩選、表達(dá) 目的：分別以鼠源抗Stx2a1的輕、重鏈為模板，篩選人源性抗Stx2a1抗體的重、輕鏈，構(gòu)建人源性抗Stx2ai的噬菌體Fab抗體。進(jìn)而從全人噬菌體Fab抗體庫中篩選出抗Stx2ai的Fab抗體，進(jìn)行表達(dá)鑒定。方法：利用RT-PCR從正常人全血淋巴細(xì)胞擴(kuò)增出全套的人Fab抗體的輕鏈基因，克隆入含鼠源性重鏈的pComb3x/mFd噬粒載體中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue后建

12、立人鼠雜合抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫。通過稀釋滴定、限制性酶切對所建的抗體庫的庫容、重組率分別進(jìn)行鑒定，以M13K07輔助噬菌體超感染，對篩選到的抗體進(jìn)行Stx2ai抗原亞單位的特異性篩選鑒定。再以同樣方法技術(shù)，利用RT-PCR從正常人全血淋巴細(xì)胞擴(kuò)增出全套的人Fab抗體的重鏈Fd基因，將其與已篩選到的人抗體輕鏈配對構(gòu)建針對Stx2a1的全人Fab抗體，以純化的Stx2ai為抗原，經(jīng)過三輪吸附-洗脫-擴(kuò)增

13、，最后對phage ELISA篩選到的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot特異性鑒定。結(jié)果：成功構(gòu)建3.1×106CFU、重組率為90％的全人Fab噬菌體抗體庫。對phage ELISA篩選到的抗體誘導(dǎo)表達(dá)，得到兩個可溶性表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)Western blot特異性鑒定均是針對抗原Stx2a1的抗體。結(jié)論：通過抗原表位定向選擇法，成功得到了全人抗EHEC O157:H7 Stx2a1噬菌體Fab抗體庫，并篩選到兩株人源性抗EHE